LY/T 3107-2019 柳树品种微卫星标记鉴别技术规程

LY/T 3107-2019 Technical regulation for willow varieties identification by SSR markers

行业标准-林业 中文简体 现行 页数:12页 | 格式:PDF

基本信息

标准号
LY/T 3107-2019
相关服务
标准类型
行业标准-林业
标准状态
现行
中国标准分类号(CCS)
国际标准分类号(ICS)
发布日期
2019-10-23
实施日期
2020-04-01
发布单位/组织
国家林业和草原局
归口单位
全国林木种子标准化技术委员会(SAC/TC 115)
适用范围
本标准规定了以柳属(Salix)植物DNA为材料,利用微卫星标记(microsatellite)对国家和省审(认)定的柳树品种进行分子鉴定的规范化操作技术。本标准适用于附录A中所列柳树品种的鉴别。
可选服务
1,提供正版标准批量采购服务,为企业合规性保驾护航,提供标准文件翻译服务,专家翻译,权威可靠
2,标准数据定制化,可定制企业云端标准数据库,为企业提供标准查询下载以及更新推送服务,实时了解标准时效更新动态
3,标准时效性核查服务,依托最新最全的标准数据库为您提供在线标准时效性核查服务,并开具权威性的标准时效性核查报告(点击查看详情
4,服务定制咨询联系电话:15102855502(微信同号),QQ:469517676

发布历史

文前页预览

LY/T 3107-2019 柳树品种微卫星标记鉴别技术规程-第1页
LY/T 3107-2019 柳树品种微卫星标记鉴别技术规程-第2页
LY/T 3107-2019 柳树品种微卫星标记鉴别技术规程-第3页
免费预览已结束,剩余9页可下载查看或在线预览全文

研制信息

起草单位:
南京林业大学、江苏省林业科学研究院、山东省林业科学研究院
起草人:
李淑娴、戴晓港、尹佟明、陈赢男、刘德玺、何旭东
出版信息:
页数:12页 | 字数:21 千字 | 开本: 大16开

内容描述

ICS65.020.20

B61

LY

中华人民共和国林业行业标准

LY/T3107—2019

柳树品种微卫星标记鉴别技术规程

TechnicalregulationforwillowvarietiesidentificationbySSRmarkers

(发布稿)

2019-10-23发布2020-04-01实施

国家林业和草原局发布

LY/T3107—2019

前言

本标准按照GB/T1.1—2009《标准化工作导则第1部分:标准的结构和编写》给出的规则起草。

本标准由全国林木种子标准化技术委员会(SAC/TC115)提出并归口。

本标准主要起草单位:南京林业大学。

本标准参加起草单位:江苏省林业科学研究院;山东省林业科学研究院。

本标准主要起草人:李淑娴、戴晓港、尹佟明、陈赢男、刘德玺、何旭东。

I

LY/T3107—2019

柳树品种微卫星标记鉴别技术规程

范围

本标准规定了以柳属(Salix)植物DNA为材料,利用微卫星标记(microsatellite)对国家和省审(认)定

的柳树品种进行分子鉴定的规范化操作技术。

本标准适用于附录A中所列柳树品种的鉴别。

2术语和定义

2.1微卫星标记microsatellite

微卫星标记,又被称为短串联重复序列(shorttandemrepeats,STRs)或简单重复序列(simplesequence

repeats,简称SSR),是指基因组中由2~6个核苷酸组成的DNA串联重复序列。

2.2基因型频率genotypefrequency

基因型频率指不同基因型在全部个体中所占的比率,全部基因型频率的总和为1或100%。

3操作程序

3.1取样和保存

取柳树幼嫩叶片5片~10片,用干燥硅胶密封保存,用于DNA提取。

3.2DNA提取所需试剂

a)1MTris:称取12.11gTris溶解到80mL超纯水中,调节pH=8.0,定容到100mL。

b)0.5MEDTA:称取18.61gEDTA溶解到80mL超纯水中,调节pH=8.0,定容到100mL。

c)5M氯化钠:称取23.38g氯化钠溶解到80mL超纯水中,定容到100mL。

d)5M醋酸钾:称取25.54g醋酸钾,200mL超纯水溶解后定容到250mL。

e)2%SDS:称取1.0g十二烷基硫酸钠(SDS),40mL超纯水溶解后定容到50mL。

f)10%CTAB:称取10gCTAB(十六烷基三甲基溴化铵)溶解到80mL超纯水中,定容到100mL。

g)氯仿异戊醇:240mL氯仿,10mL异戊醇混合。

h)70%乙醇:70mL乙醇,加入30mL超纯水。

i)CTAB裂解液:1mL1MTris(pH=8.0),4mL0.5MEDTA(pH=8.0),28mL5M氯化钠,10mL10%

CTAB,5g聚乙烯吡咯烷酮,定容到100mL。

j)TBE缓冲液(10×):称取108gTris碱和55g硼酸,加入40mL0.5MEDTA溶液(pH=8.0),用

1

LY/T3107—2019

800mL双蒸水溶解后定容到1L,高温灭菌。

3.3DNA提取

DNA提取采用改良的CTAB法:

a)向2mL离心管中加入400µLCTAB裂解液,10µL的10mg/mLRnase,2µLβ-巯基乙醇。

b)取柳树叶片3-5片,放入研钵中加入液氮充分研磨,将研磨后的样品转入3.2.1的离心管中,

涡旋混匀后,65℃保温10min,再加入400µL2%SDS,涡旋混匀,65℃保温10min。

c)向3.2.2的离心管中加入130µL5M醋酸钾,涡旋混匀,将离心管插入冰中保存10min。

d)加入800µL氯仿异戊醇溶液(氯仿:异戊醇=24:1),涡旋混匀后,12000rpm离心5min。

e)将上清液转移到新的2mL离心管中,加入等体积预冷的异丙醇,颠倒离心管8-10次,-20℃冻

存20min。

f)取出离心管,12000rpm离心5min,去除上清液。

g)加入500µL的70%乙醇,12000rpm离心2min,去除上清液。

h)重复3.2.7步骤一次。

i)加入500µL无水乙醇,12000rpm离心5min,去除上清液,离心管开盖室温放置30min。

j)加入100µLTE缓冲液,37℃保存5min,涡旋混匀获得DNA,将样品放在-80℃长期保存。

3.4DNA定量及质量检测

a)取2µLDNA用微量核酸蛋白检测仪检测,直接读出DNA浓度和A260/280的比值。

b)根据上述测定浓度,取200ngDNA,加入2µL溴酚蓝,在1%的琼脂糖凝胶上电泳,加入5000

bpmarker作对照,稳压100V,电泳缓冲液为1×TBE,电泳结束后用凝胶成像系统记录拍照。

c)根据微量核酸蛋白检测仪的定量结果,将样品稀释成20ng/µL,在-20℃下保存备用。

3.5目的片段PCR扩增

3.5.116对SSR引物及序列见附录B。

3.5.2目的片段扩增反应体系为15µL,具体试剂用量见表1。

表1PCR扩增反应体系

试剂浓度所需体积(µL)

2+

PCRbuffer10×PCRbuffer(MgPlus)1.5

Taq酶5U/µL0.2

ForwardPrimer5mM1

ReverePrimer5mM1

DNA20ng/µL2

dNTP5mM0.3

dUTP250nM1

2

LY/T3107—2019

HO6.8

2

3.5.3PCR扩增反应

将配制的扩增体系加入到8连管或96孔PCR板中,盖上管盖后涡旋混匀,在3000rpm下离心5s,

放入PCR仪中扩增,扩增程序为:

1)94℃变性4min;

2)94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸1min,共35个循环;

3)72℃延伸10min,15℃保存。

3.6目的片段检测

3.6.1PCR产物变性

PCR产物用双蒸水稀释10-15倍,取1µL稀释产物加入到9µL的Loadingbuffer(91%超纯甲酰胺,

9%内标Genescan500Rox)后混匀;在PCR仪上运行变性程序:95℃变性5min,迅速放冰上冷却。

3.6.2PCR扩增产物检测

PCR产物检测采用ABIPRISM3130xl分析系统。从数据采集软件中创建一个片段分析程序,选择

片段分析模式以及光谱校正所用试剂盒类型。创建一个自动分析模板,填写分析样品名称,选择样品类

型、内标类型、分析方法等。将变性的产物转入96孔PCR板,盖上仪器自带的PCR板盖,放入仪器

中。在软件中将PCR板链接到仪器,点击开始进行基因型分型。

3.6.3PCR扩增产物条带分析

采用基因型分析软件打开基因型分型的结果,根据内参大小直接读出每个样品目的片段的大小。

4送检样品分析

送检样品分析程序为:

a)随机选取附录B.1中的一对SSR引物,对待检样品进行PCR扩增。

b)将待检样品扩增得到的条带和附录C.1-C.2中对应引物的标准谱带相比较。

c)如果所有扩增条带和附录C.1-C.2中对应引物某一品种的标准谱带完全相同,即判定为相同品

种;如果扩增条带和其中几个品种的条带完全相同,则增加一对引物进行检测,直至检测到唯

一匹配的品种。

d)如果待检样品所有扩增条带有一个以上位点与标准谱带不同,即判定为不同品种。

e)根据基因型频率判定所鉴定品种真实性的准确率,见附录D。

3

LY/T3107—2019

附录A

(资料性附录)

本标准适用鉴定的柳树品种表

表A.1本标准适用鉴定的柳树品种

序号品种中文名拉丁名

1苏柳172SalixjiangsuensisCL‘J172’

2苏柳485S.jiangsuensisCL‘485’

3苏柳52-2S.jiangsuensisCL‘52-2’

4苏柳795S.jiangsuensisCL‘J795’

5苏柳799S.jiangsuensisCL‘J799’

6苏柳J932S.jiangsuensisCL‘J932’

7簸杞柳JW9-6S.integra×S.suchowensis‘JW9-6’

8簸杞柳JW8-26S.suchowensis×S.integra‘JW8-26’

9“旱沙王”北沙柳S.psammophila‘Hanshawang’

10银芽柳J1037S.agyrobractealis‘J1037’

11银芽柳J1050S.agyrobractealis‘J1050’

12银芽柳J1055S.agyrobractealis‘J1055’

13银芽柳J887S.agyrobractealis‘J887’

14金丝垂柳J1010S.aureo-pendula‘J1010’

15金丝垂柳J1011S.aureo-pendula‘J1011’

16花叶柳S.integravar.‘HakuroNishiki’

17渤海柳1号S.matsudanaKoidz‘Bohailiu-1’

18渤海柳2号S.matsudanaKoidz‘Bohailiu-2’

19渤海柳3号S.matsudanaKoidz‘Bohailiu-3’

20渤海柳4号S.matsudanaKoidz‘Bohailiu-4’

21旱柳S.matsudanaKoidz

22沙柳S.psammophila

23黄柳S.gordejeviiChangetSkV.

4

LY/T3107—2019

附录B

(规范性附录)

柳树品种鉴别16对SSR引物序列

表B.1柳树品种鉴别的16对SSR引物

序号引物名称引物正向序列(5’-3’)引物反向序列(5’-3’)

1W254-1AACATTCTGCTTCTTCCTTTAACCTCCATTACCATCCATA

2W46-460AAGCAAGCAAAAGTCAAGAGAGTATGCCAAGCAAGAAGAA

3W64-41TCAGAGCCTGGTTCATAAACAAATGCCAGAGCTAAA

4W64-65GCATACTTGGGCGTTGATTGACTTGGGTTGGGTTTT

5W64-255GTCTGAACCCTCATCTATCTGGAATCCATAATACAC

6W64-272TCACTTGCCGCCCTTCTTTGACGCCGCTGTAACCAC

7W64-286AAAGAATACATTTTAGGTGGATTTCAAGGTTCAATCAAGTTA

8W64-293GCAAAAGCCAAAAGGAGAAACCAGCAGAGGA

推荐标准