LY/T 3107-2019 柳树品种微卫星标记鉴别技术规程
LY/T 3107-2019 Technical regulation for willow varieties identification by SSR markers
基本信息
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发布历史
-
2019年10月
研制信息
- 起草单位:
- 南京林业大学、江苏省林业科学研究院、山东省林业科学研究院
- 起草人:
- 李淑娴、戴晓港、尹佟明、陈赢男、刘德玺、何旭东
- 出版信息:
- 页数:12页 | 字数:21 千字 | 开本: 大16开
内容描述
ICS65.020.20
B61
LY
中华人民共和国林业行业标准
LY/T3107—2019
柳树品种微卫星标记鉴别技术规程
TechnicalregulationforwillowvarietiesidentificationbySSRmarkers
(发布稿)
2019-10-23发布2020-04-01实施
国家林业和草原局发布
LY/T3107—2019
前言
本标准按照GB/T1.1—2009《标准化工作导则第1部分:标准的结构和编写》给出的规则起草。
本标准由全国林木种子标准化技术委员会(SAC/TC115)提出并归口。
本标准主要起草单位:南京林业大学。
本标准参加起草单位:江苏省林业科学研究院;山东省林业科学研究院。
本标准主要起草人:李淑娴、戴晓港、尹佟明、陈赢男、刘德玺、何旭东。
I
LY/T3107—2019
柳树品种微卫星标记鉴别技术规程
范围
本标准规定了以柳属(Salix)植物DNA为材料,利用微卫星标记(microsatellite)对国家和省审(认)定
的柳树品种进行分子鉴定的规范化操作技术。
本标准适用于附录A中所列柳树品种的鉴别。
2术语和定义
2.1微卫星标记microsatellite
微卫星标记,又被称为短串联重复序列(shorttandemrepeats,STRs)或简单重复序列(simplesequence
repeats,简称SSR),是指基因组中由2~6个核苷酸组成的DNA串联重复序列。
2.2基因型频率genotypefrequency
基因型频率指不同基因型在全部个体中所占的比率,全部基因型频率的总和为1或100%。
3操作程序
3.1取样和保存
取柳树幼嫩叶片5片~10片,用干燥硅胶密封保存,用于DNA提取。
3.2DNA提取所需试剂
a)1MTris:称取12.11gTris溶解到80mL超纯水中,调节pH=8.0,定容到100mL。
b)0.5MEDTA:称取18.61gEDTA溶解到80mL超纯水中,调节pH=8.0,定容到100mL。
c)5M氯化钠:称取23.38g氯化钠溶解到80mL超纯水中,定容到100mL。
d)5M醋酸钾:称取25.54g醋酸钾,200mL超纯水溶解后定容到250mL。
e)2%SDS:称取1.0g十二烷基硫酸钠(SDS),40mL超纯水溶解后定容到50mL。
f)10%CTAB:称取10gCTAB(十六烷基三甲基溴化铵)溶解到80mL超纯水中,定容到100mL。
g)氯仿异戊醇:240mL氯仿,10mL异戊醇混合。
h)70%乙醇:70mL乙醇,加入30mL超纯水。
i)CTAB裂解液:1mL1MTris(pH=8.0),4mL0.5MEDTA(pH=8.0),28mL5M氯化钠,10mL10%
CTAB,5g聚乙烯吡咯烷酮,定容到100mL。
j)TBE缓冲液(10×):称取108gTris碱和55g硼酸,加入40mL0.5MEDTA溶液(pH=8.0),用
1
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800mL双蒸水溶解后定容到1L,高温灭菌。
3.3DNA提取
DNA提取采用改良的CTAB法:
a)向2mL离心管中加入400µLCTAB裂解液,10µL的10mg/mLRnase,2µLβ-巯基乙醇。
b)取柳树叶片3-5片,放入研钵中加入液氮充分研磨,将研磨后的样品转入3.2.1的离心管中,
涡旋混匀后,65℃保温10min,再加入400µL2%SDS,涡旋混匀,65℃保温10min。
c)向3.2.2的离心管中加入130µL5M醋酸钾,涡旋混匀,将离心管插入冰中保存10min。
d)加入800µL氯仿异戊醇溶液(氯仿:异戊醇=24:1),涡旋混匀后,12000rpm离心5min。
e)将上清液转移到新的2mL离心管中,加入等体积预冷的异丙醇,颠倒离心管8-10次,-20℃冻
存20min。
f)取出离心管,12000rpm离心5min,去除上清液。
g)加入500µL的70%乙醇,12000rpm离心2min,去除上清液。
h)重复3.2.7步骤一次。
i)加入500µL无水乙醇,12000rpm离心5min,去除上清液,离心管开盖室温放置30min。
j)加入100µLTE缓冲液,37℃保存5min,涡旋混匀获得DNA,将样品放在-80℃长期保存。
3.4DNA定量及质量检测
a)取2µLDNA用微量核酸蛋白检测仪检测,直接读出DNA浓度和A260/280的比值。
b)根据上述测定浓度,取200ngDNA,加入2µL溴酚蓝,在1%的琼脂糖凝胶上电泳,加入5000
bpmarker作对照,稳压100V,电泳缓冲液为1×TBE,电泳结束后用凝胶成像系统记录拍照。
c)根据微量核酸蛋白检测仪的定量结果,将样品稀释成20ng/µL,在-20℃下保存备用。
3.5目的片段PCR扩增
3.5.116对SSR引物及序列见附录B。
3.5.2目的片段扩增反应体系为15µL,具体试剂用量见表1。
表1PCR扩增反应体系
试剂浓度所需体积(µL)
2+
PCRbuffer10×PCRbuffer(MgPlus)1.5
Taq酶5U/µL0.2
ForwardPrimer5mM1
ReverePrimer5mM1
DNA20ng/µL2
dNTP5mM0.3
dUTP250nM1
2
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HO6.8
2
3.5.3PCR扩增反应
将配制的扩增体系加入到8连管或96孔PCR板中,盖上管盖后涡旋混匀,在3000rpm下离心5s,
放入PCR仪中扩增,扩增程序为:
1)94℃变性4min;
2)94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸1min,共35个循环;
3)72℃延伸10min,15℃保存。
3.6目的片段检测
3.6.1PCR产物变性
PCR产物用双蒸水稀释10-15倍,取1µL稀释产物加入到9µL的Loadingbuffer(91%超纯甲酰胺,
9%内标Genescan500Rox)后混匀;在PCR仪上运行变性程序:95℃变性5min,迅速放冰上冷却。
3.6.2PCR扩增产物检测
PCR产物检测采用ABIPRISM3130xl分析系统。从数据采集软件中创建一个片段分析程序,选择
片段分析模式以及光谱校正所用试剂盒类型。创建一个自动分析模板,填写分析样品名称,选择样品类
型、内标类型、分析方法等。将变性的产物转入96孔PCR板,盖上仪器自带的PCR板盖,放入仪器
中。在软件中将PCR板链接到仪器,点击开始进行基因型分型。
3.6.3PCR扩增产物条带分析
采用基因型分析软件打开基因型分型的结果,根据内参大小直接读出每个样品目的片段的大小。
4送检样品分析
送检样品分析程序为:
a)随机选取附录B.1中的一对SSR引物,对待检样品进行PCR扩增。
b)将待检样品扩增得到的条带和附录C.1-C.2中对应引物的标准谱带相比较。
c)如果所有扩增条带和附录C.1-C.2中对应引物某一品种的标准谱带完全相同,即判定为相同品
种;如果扩增条带和其中几个品种的条带完全相同,则增加一对引物进行检测,直至检测到唯
一匹配的品种。
d)如果待检样品所有扩增条带有一个以上位点与标准谱带不同,即判定为不同品种。
e)根据基因型频率判定所鉴定品种真实性的准确率,见附录D。
3
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附录A
(资料性附录)
本标准适用鉴定的柳树品种表
表A.1本标准适用鉴定的柳树品种
序号品种中文名拉丁名
1苏柳172SalixjiangsuensisCL‘J172’
2苏柳485S.jiangsuensisCL‘485’
3苏柳52-2S.jiangsuensisCL‘52-2’
4苏柳795S.jiangsuensisCL‘J795’
5苏柳799S.jiangsuensisCL‘J799’
6苏柳J932S.jiangsuensisCL‘J932’
7簸杞柳JW9-6S.integra×S.suchowensis‘JW9-6’
8簸杞柳JW8-26S.suchowensis×S.integra‘JW8-26’
9“旱沙王”北沙柳S.psammophila‘Hanshawang’
10银芽柳J1037S.agyrobractealis‘J1037’
11银芽柳J1050S.agyrobractealis‘J1050’
12银芽柳J1055S.agyrobractealis‘J1055’
13银芽柳J887S.agyrobractealis‘J887’
14金丝垂柳J1010S.aureo-pendula‘J1010’
15金丝垂柳J1011S.aureo-pendula‘J1011’
16花叶柳S.integravar.‘HakuroNishiki’
17渤海柳1号S.matsudanaKoidz‘Bohailiu-1’
18渤海柳2号S.matsudanaKoidz‘Bohailiu-2’
19渤海柳3号S.matsudanaKoidz‘Bohailiu-3’
20渤海柳4号S.matsudanaKoidz‘Bohailiu-4’
21旱柳S.matsudanaKoidz
22沙柳S.psammophila
23黄柳S.gordejeviiChangetSkV.
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附录B
(规范性附录)
柳树品种鉴别16对SSR引物序列
表B.1柳树品种鉴别的16对SSR引物
序号引物名称引物正向序列(5’-3’)引物反向序列(5’-3’)
1W254-1AACATTCTGCTTCTTCCTTTAACCTCCATTACCATCCATA
2W46-460AAGCAAGCAAAAGTCAAGAGAGTATGCCAAGCAAGAAGAA
3W64-41TCAGAGCCTGGTTCATAAACAAATGCCAGAGCTAAA
4W64-65GCATACTTGGGCGTTGATTGACTTGGGTTGGGTTTT
5W64-255GTCTGAACCCTCATCTATCTGGAATCCATAATACAC
6W64-272TCACTTGCCGCCCTTCTTTGACGCCGCTGTAACCAC
7W64-286AAAGAATACATTTTAGGTGGATTTCAAGGTTCAATCAAGTTA
8W64-293GCAAAAGCCAAAAGGAGAAACCAGCAGAGGA
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