GB/T 21103-2007 动物源性饲料中哺乳动物源性成分定性检测方法 实时荧光PCR方法

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犅４６

中华人民共和国国家标准

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动物源性饲料中哺乳动物源性成分定性

检测方法实时荧光犘犆犚方法

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２００７１０２４发布２００８０４０１实施

中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局

发布

中国国家标准化管理委员会

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前言

本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出。

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动物源性饲料中哺乳动物源性成分定性

检测方法实时荧光犘犆犚方法

１范围

本标准规定了动物源性饲料中哺乳动物源性成分（包括牛、绵羊、山羊、猪、兔、鹿、马、驴、狗、猫等）

实时荧光ＰＣＲ检测方法，该检测方法的检出限为０．１％。

本标准适用于动物源性饲料中哺乳动物源性成分的定性检测。

２规范性引用文件

下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有

的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究

是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。

ＧＢ６６８２分析实验室用水规格和试验方法

／饲料采样（／—，：，）

ＧＢＴ１４６９９．１ＧＢＴ１４６９９．１２００５ＩＳＯ６４９７２００２ＩＤＴ

／基因检验实验室技术要求

ＳＮＴ１１９３

３术语和定义

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下列术语和定义适用于本标准。

３．１

实时荧光犘犆犚狉犲犪犾狋犻犿犲犘犆犚

实时荧光聚合酶链式反应。

３．２

值

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狔

每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。

４原理

采用实时荧光技术，根据线粒体的核糖体（，

ＴａＭａｎＰＣＲＤＮＡ１２ＳＲＮＡ１２ＳｒｉｂｏｓｏｍａｌＲＮＡ

ｑ

１２ＳｒＲＮＡ）基因上哺乳动物与非哺乳动物种间序列差异而进行哺乳动物源性成分鉴定。利用裂解液破

碎细胞，三氯甲烷抽提蛋白质，异丙醇沉淀得到ＤＮＡ；以提取的ＤＮＡ为模板进行实时荧光ＰＣＲ扩增。

以实时荧光检测技术，采用多重ＰＣＲ方法，将所用试剂配制成预混合形式，组建成实时荧光ＰＣＲ哺乳

动物ＤＮＡ检测试剂盒。在同一反应管内对哺乳动物的１２ＳｒＲＮＡ基因及内参照基因同时进行扩增，

并通过标记两种不同荧光物质羧基荧光素（，）、六氯荧光素（

６６ｃａｒｂｏｘｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎＦＡＭ５５ｈｅｘａｃｈｌｏ

ｙ

，）的探针进行特异性杂交，两色荧光同步检测。其中，对内参照反应的检测，可以监

ｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎＨＥＸ

控反应是否正常进行，防止假阴性结果。观察实时荧光ＰＣＲ的增幅曲线，从而对动物源性饲料中哺乳

动物源性成分进行快速检测。

５试剂与材料

除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，实验用水符合ＧＢ６６８２的要求。

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５．１犇犖犃提取用试剂

５．１．１三氯甲烷。

５．１．２异戊醇。

５．１．３异丙醇。

５．１．４７０％乙醇。

裂解液：（，十六烷基三甲基溴化铵），／

５．１．５１％ＣＴＡＢｃｅｔｌｔｒｉｔｈｌａｍｍｏｎｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ０．０５ｍｏｌＬ

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（）［：（），三（羟甲基