DB34/T 2815-2017 羽绒羽毛中沙门氏菌检测方法 酶联免疫法

ICS

61.020

Y76

DB34

安徽省地方标准

DB34/T2815—2017

羽绒羽毛中沙门氏菌检测方法酶联免疫法

MethodfordetectionofSalmonellaindownandfeather:Euzymelinked

immunosorbentassay（ELISA）

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2017-03-30发布2017-04-30实施

安徽省质量技术监督局发布

DB34/T2815—2017

前

言

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。

本标准由安徽省检验检疫科学技术研究院提出。

本标准由安徽省动植物检验检疫标准化技术委员会归口。

本标准主要起草单位：安徽省检验检疫科学技术研究院。

本标准主要起草人：孙娟娟、陈雪娇、李云飞、宗凯、郑海松、余晓峰。

I

DB34/T2815—2017

羽绒羽毛中沙门氏菌检测方法酶联免疫法

1范围

本标准规定了羽绒羽毛中沙门氏菌的酶联免疫检测方法。

本标准适用于各种品种、规格的羽绒羽毛及其制品填充料中沙门氏菌的检验。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3基本信息

沙门氏菌（salmonella）为革兰氏阴性、两端钝圆的短杆菌，（0.7～1.5μm）×（2～5μm）散在，

无荚膜和芽孢，（除鸡白痢沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌外）都具有周身鞭毛，能运动，大多数具有菌毛，

能吸附于宿主细胞表面或凝集豚鼠红细胞。沙门氏菌具有复杂的抗原结构，一般沙门氏菌具有菌体(O)

抗原、鞭毛(H)抗原和表面抗原(荚膜或包膜抗原)三种抗原，目前已知有2000多种血清型。

4方法原理

根据沙门氏菌在选择性培养基上形成的菌落特征，或根据酶联免疫筛选的阳性结果挑出可疑菌落，

依据进一步的生化鉴定以及血清学鉴定的结果，对沙门氏菌进行判定。

5仪器设备

恒温培养箱、冰箱、干热灭菌箱、高压蒸汽灭菌锅、均质器、振荡器、水浴锅、摇床、电子天平、

硝酸纤维素薄膜（0.45μm）、抽滤器、无菌锥形瓶、无菌塑料袋无菌吸管10ml(具0.1ml刻度)或

微量移液器及吸头、无菌培养皿、无菌试管、pH计或pH试纸、全自动免疫酶标分析仪、全自动微生

物生化鉴定系统。

6培养基和试剂

缓冲蛋白胨水（BPW）、四磺酸钠黄绿（TTB）增菌液、亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液、亚硫酸铋（BS）

琼脂、木糖蓝氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂、沙门氏菌属显色培养基、沙门氏菌O和H诊断血清、生化

鉴定试剂条、生化鉴定卡。

实验用水应符合GB/T6682的规定。培养基的配制见附录A。

1

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7检验程序

见图1。

图1羽绒羽毛中沙门氏菌的检验程序

8操作步骤

8.1试样前处理

用无菌镊子和剪刀取出两个各12g样品，称量，精确到0.1g，放入烧杯中，每个烧杯加入1200

ml0.1％蛋白胨生理盐水，室温下，摇床摇匀（160rpm）或机械（加玻璃珠）搅拌3h，无菌纱布过

滤后混合滤液，取2000ml原始滤液，用过滤器经孔径0.45μm滤膜过滤，滤膜取下，放入装有100

mlBPW的均质袋中进行前增菌。36℃±1℃培养18～24h。

8.2沙门氏菌分离培养

轻轻摇动培养过的样品前增菌混合液，移取1ml，转种于10mlTTB中，于42℃±1℃培养18～

24h。同时，另取1ml，转种于10mlSC中，于36℃±1℃培养18～24h。

2

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分别用接种环取增菌液1环，划线接种于一个BS琼脂平板和一个沙门氏菌属显色培养基平板（或

XLD琼脂平板）。于36℃±1℃培养18～24h（沙门氏菌属显色培养基平板）或40～48h（BS琼脂

平板）。

观察各个平板上生长的菌落，各个平板上的菌落特征见表1。

表1沙门氏菌属在不同选择性琼脂平板上的菌落特征

选择性琼脂平板沙门氏菌

菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色或棕色；

BS琼脂

有些菌株形成灰绿色的菌落，周围培养基不变。

蓝绿色或蓝色，多数菌落中心黑色或几乎全黑色；

HE琼脂

有些菌株为黄色，中心黑色或全黑色。

菌落呈粉红色，带或不带黑色中心，有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心，或呈现全部

XLD琼脂黑色的菌落；

有些菌株为黄色菌落，带或不带黑色中心。

沙门氏菌属显色培养基按照显色培养基的说明进行判定。

用SC或TTB前增菌的混合液，可直接用于全自动免疫酶标分析仪进行初筛，初筛阴性可直接判

定未检出沙门氏菌,初筛阳性须进一步做生化鉴定。

初筛阳性的混合液用接种环划线接种于一个BS琼脂平板和一个沙门氏菌属显色培养基平板（或

XLD琼脂平板）。操作同上。

8.3生化鉴定

在选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落，接种三糖铁琼脂，先在斜面划线，再于

底层穿刺；接种针不要灭菌，直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板，于36℃±1℃培养

18～24h，必要时可延长至48h。

在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内，沙门氏菌属的反应结果见表2。

表2沙门氏菌属在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内的反应结果

三糖铁琼脂赖氨酸脱羧酶试验

初步判断

斜面底层产气硫化氢培养基

KA+(－)+(－)+可疑沙门氏菌属

KA+(－)+(－)－可疑沙门氏菌属

AA+(－)+(－)+可疑沙门氏菌属

AA+/－+/－－非沙门氏菌属

KK+/－+/－+/－非沙门氏菌属

注：K:产碱，A：产酸；+：阳性，－：阴性；+(－)：多数阳性，少数阴性；+/－：阳性或阴性。

接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时，可直接接种蛋白胨水（供做靛基质试验）、尿

素琼脂（pH7.2）、氰化钾（KCN）培养基，也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑取可疑菌落接

种于36℃±1℃培养18～24h，必要时可延长至48h，按表3判定结果。

将已挑菌落的平板储存于2℃～5℃或室温至少保留24h，以备必要时复查。

3

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表3沙门氏菌属生化反应初步鉴别表

硫化氢氰化钾

反应序号靛基质pH7.2尿素赖氨酸脱羧酶

（H2S）（KCN）

A1＋－－－＋

A2＋＋－－＋

A3－－－－+/－

注：+：阳性，－：阴性；+/－：阳性或阴性。

反应序号A1：典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、KCN和赖氨酸脱羧酶3项中有1项异常，

按表4可判定为沙门氏菌。如有2项异常为非沙门氏菌。

反应序号A2：补做甘露醇和山梨醇试验，沙门氏菌靛基质阳性变体两项实验结果均为阳性，但需

要结合血清学鉴定结果进行判定。

反应序号A3：补做ONPG。ONPG阴性为沙门氏菌，同时赖氨酸脱羧酶阳性，甲型副伤寒沙门氏菌

为赖氨酸脱羧酶阴性。

必要时按表5进行沙门氏菌生化群的鉴别。

表4沙门氏菌属生化反应初步鉴别表

pH7.2尿素氰化钾（KCN）赖氨酸脱羧酶判定结果

－－－甲型副伤寒沙门氏菌（要求血清学鉴定结果）

－＋＋沙门氏菌Ⅳ或Ⅴ（要求符合本群生化特性）

＋－＋沙门氏菌个别变体（要求血清学鉴定结果）

注：+表示阳性，－表示阴性。

表5沙门氏菌属各生化群的鉴别

项目ⅠⅡⅢⅣⅤⅥ

卫矛醇＋＋－－＋－

山梨醇＋＋＋＋＋－

水杨苷－－－＋－－

ONPG－－＋－＋－

丙二酸盐－＋＋－－－

KVN－－－＋＋－

注：+表示阳性，－表示阴性。

如选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统，可从沙门显色培养基或BS培养基上挑取可

疑菌落，经营养琼脂平板纯化后，用生理盐水制备成浊度适当的菌悬液，使用生化鉴定试剂盒或全自动

微生物生化鉴定系统进行鉴定。全自动生化鉴定系统可直接鉴定出沙门氏菌菌型。

8.4血清学分型（选做）

8.4.1抗原的准备

一般采用1.2％～1.5％琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。O血清不凝集时，将菌株接种在

琼脂量较高的（如2％～3％）培养基上再检查；如果是由于Vi抗原的存在而阻止了O凝集反应时，

可挑取菌苔于1mL生理盐水中做成浓菌液，于酒精灯火焰上煮沸后再检查。H抗原发育不良时，将菌

4

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株接种在0.55％～0.65％半固体琼脂平板的中央，菌落蔓延生长时，在其边缘部分取菌检查；或将菌

株通过装有0.3％～0.4％半固体琼脂的小玻管1次～2次，自远端取菌培养后再检查。

8.4.2O抗原的鉴定

在玻片上划出2个约1cm×2cm的区域，挑取1环待测菌，各放1/2环于玻片上的每一区域

上部，在其中一个区域下部加1滴多价菌体（O）抗血清，在另一区域下部加入1滴生理盐水，作为

对照。再用无菌的接种环或针分别将两个区域内的菌落研成乳状液。将玻片倾斜摇动混合1min，并对

着黑暗背景进行观察，任何程度的凝集现象皆为阳性反应。

用A～F多价O血清做玻片凝集试验，同时用生理盐水做对照。在生理盐水中自凝者为粗糙形菌

株，不能分型。

被A～F多价O血清凝集者，依次用O4；O3、O10；O7；O8；O9；O2和O11因子血清做凝集试

验。根据试验结果，判定O群。被O3、O10血清凝集的菌株，再用O10、O15、O34、O19单因子血清

做凝集试验，判定E1、E2、E3、E4各亚群，每一个O抗原成分的最后确定均应根据O单因子血清的

检查结果，没有O单因子血清的要用两个O复合因子血清进行核对。

不被A～F多价O血清凝集者，先用9种多价O血清检查，如有其中一种血清凝集，则用这种

血清所包括的O群血清逐一检查，以确定O群。

每种多价O血清所包括的O因子如下：

——O多价1A，B，C，D，E，F，群（并包括6,14群）

——O多价213，16，17，18，21群

——O多价328，30，35，38，39群

——O多价440，41，42，43群

——O多价544，45，47，48群

——O多价650，51，52，53群

——O多价755，56，57，58群

——O多价859，60，61，62群

——O多价963，65，66，67群

8.4.3H抗原的鉴定

属于A～F各O群的常见菌型，依次用表6所述H因子血清检查第1相和第2相的H抗原。

表6A～F群常见菌型H抗原表

O群第1相第2相

Aa

无

Bg,f,s

无

Bi,b,d

2

C1k,v,r,c

5，Z15

C2b,d,r

2,5

D(不产气的)d

无

D（产气的）g,m,p,q

无

E1h,v

6，w,x

E4g,s,t

无

E4i

5

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不常见的菌型，先用8种多价H血清检查，如有其中一种或两种血清凝集，则再用这一种或两种

血清所包括的各种H因子血清逐一检查，以第1相和第2项的H抗原。

8种多价H血清所包括的H因子如下：

——H多价1a，b，c，d，i

——H多价2eh，enx，enz15，fg，gms，gpu，gp，gq，mt，gz51

——H多价3k，r，y，z，z10，lv，lw，lz13，lz28，lz40

——H多价41,2；1,5；1,6；1,7；z6

——H多价5z4z23，z4z24，z4z32，z29，z35，z36，z38

——H多价6z39，z41，z42，z44

——H多价7z52，z53，z54，z55

——H多价8z56，z57，z60，z61，z62

每一个H抗原成分的最后确定均应根据H单因子血清的检查结果，没有H单因子血清的要用两

个H复合因子血清进行核对。检出第1相H抗原而未检出第2相H抗原的或检出第2相H抗原

而未检出第1相H抗原的,可在琼脂斜面上移种1～2代后再检查。

8.4.4Vi抗原的鉴定

用Vi因子血清检查。已知具有Vi抗原的菌型有：伤寒沙门氏菌，丙型副伤寒沙门氏菌,都柏林

沙门氏菌。

8.4.5菌型的判定

根据血清学分型鉴定的结果，按照附录B或有关沙门氏菌属抗原表判定菌型。

9结果与报告

综合以上生化试验和血清学鉴定的结果，报告20g样品中检出或未检出沙门氏菌。

6

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AA

附录A

（资料性附录）

培养基和试剂

A.1缓冲蛋白胨水（BPW）

A.1.1成分

蛋白胨10.0g

氯化钠5.0g

磷酸氢二钠（含12个结晶水）9.0g

磷酸二氢钾1.5g

蒸馏水1000mL

pH7.2±0.2

A.1.2制法

将各成分加入蒸馏水中，搅混均匀，静置约10min，煮沸溶解，调节pH，高压灭菌121℃，15min。

A.2四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液

A.2.1基础液

蛋白胨10.0g

牛肉膏5.0g

氯化钠3.0g

碳酸钙45.0g

蒸馏水1000mL

pH7.0±0.2

除碳酸钙外，将各成分加入蒸馏水中煮沸溶解，再加入碳酸钙，调节pH，高压灭菌121℃，20min。

A.2.2硫代硫酸钠溶液

硫代硫酸钠（含5个结晶水）50.0g

蒸馏水加至100mL

高压灭菌121℃，20min。

A.2.3碘溶液

碘片20.0g

碘化钾25.0g

蒸馏水加至100mL

将碘化钾充分溶解于少量的蒸馏水中，再投入碘片，振摇玻瓶