DB37/T 3533-2019 驴骡马皮张源性成分鉴定 实时荧光定性PCR法

ICS65.020.01

B40

DB37

山东省地方标准

DB37/T3533—2019

驴骡马皮张源性成分鉴定

实时荧光定性PCR法

Identificationofdonkey,mule/hinnyandhorsederivedmaterialsinleather

Real-timefluorescentPCRmethod

2019-03-21发布2019-04-21实施

山东省市场监督管理局发布

DB37/T3533—2019

目次

前言................................................................................II

1范围...............................................................................1

2规范性引用文件.....................................................................1

3术语和定义.........................................................................1

4原理...............................................................................1

5试剂或材料.........................................................................1

5.1试剂...........................................................................1

5.2材料...........................................................................2

5.3配制溶液.......................................................................2

6仪器设备...........................................................................3

7检测用引物和探针...................................................................3

8试验步骤...........................................................................3

8.1样本制备.......................................................................3

8.2DNA提取........................................................................3

8.3实时荧光PCR反应...............................................................3

9试验数据处理.......................................................................4

9.1PCR有效性判定..................................................................4

9.2检测结果分析和表述.............................................................4

10检测过程中防止交叉污染的措施......................................................4

附录A（规范性附录）实时荧光定性PCR引物/探针序列、反应体系和结果判定............5

附录B（资料性附录）目的基因扩增靶标参考序列....................................7

I

DB37/T3533—2019

前言

本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。

本标准由山东省畜牧兽医局提出并监督实施。

本标准由山东省畜牧专业标准化技术委员会归口。

本标准起草单位：山东省农业科学院生物技术研究中心、山东东阿国胶堂阿胶药业有限公司、山东

宏济堂制药集团股份有限公司、济南张景牧业科技发展有限公司。

本标准主要起草人：张全芳、胡悦、范阳阳、刘艳艳、董书光、徐慧敏、孟朝红、余彩娟、耿加亮、

郝大魁、张同清、谭晴晴、步迅、陈淑娟。

II

DB37/T3533—2019

驴骡马皮张源性成分鉴定实时荧光定性PCR法

1范围

本标准规定了驴、骡和马3种动物皮张源性成分的实时荧光定性PCR检测方法。

本标准适用于动物皮张及初加工品中驴、骡和马3种源性成分的定性检测。

本方法检出限为0.5%。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

实时荧光PCRreal-timefluorescencePCR

在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监控整个PCR进程，对未知模板进行定性或

定量分析。

3.2

Ct值cyclethreshold

每个实时荧光PCR反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。

4原理

根据核基因CKM(creatinekinaseofmuscle)为靶基因设计马属动物通用引物以及驴和马特异性探

针，采用TaqMan实时荧光PCR技术进行扩增，根据PCR扩增反应的荧光信号及循环阈值，判定动物皮张驴、

马和骡3种动物源性成分。

5试剂或材料

除另有规定外，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和符合GB/T6682规定的一级水。

5.1试剂

1

DB37/T3533—2019

5.1.1氯化钠（NaCl）。

5.1.2浓盐酸（HCl）。

5.1.3三羟甲基氨基甲烷（Trisbase）。

5.1.4二水乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA·2H2O）。

5.1.5十二烷基硫酸钠（SDS）。

5.1.6蛋白酶冻干品。

5.1.7异硫氰酸胍（GuSCN）。

5.1.8硅珠。

5.1.9无水乙醇。

5.2材料

5.2.1驴、骡和马3种动物皮张源性成分实时荧光PCR定性检测试剂盒。

5.2.22×TaqManMasterMix：含有TaqDNA聚合酶（终浓度1U/20µL）、Mg2+（终浓度2.0mmol/µL）、

dNTPs（终浓度0.2mmol/µL）。

5.3配制溶液

5.3.11mol/LTris-HCl(pH8.0）溶液：称取12.1g三羟甲基氨基甲烷置于100mL烧杯中，加入

80mL水，用浓盐酸调节pH至8.0，转移至100mL容量瓶中,加水定容至刻度，103.4KPa蒸汽压（121

℃）灭菌20min，室温保存待用。

5.3.21mol/LTris-HCl(pH6.4）溶液：称取12.1gTris置于100mL烧