GB/T 28976-2012 草莓潜隐环斑病毒检疫鉴定方法

ICS65.020.01

B16

道昌

中华人民共和国国家标准

GB/T28976-2012

草莓潜隐环斑病毒检疫鉴定方法

Detectionandidentificationofstrawberrylatentringspotvirus

2012-12-31发布

2013-06-01实施

中华人民共和国国家质量监督检验检菇总局也舍

中国国家标准化管理委员会a叩

GB/T28976-2012

目。吾

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。

本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口．

本标准起草单位z中华人民共和国上海出入境检验捡疫局、中华人民共和国宁波出入境检验检疫

局、中华人民共和国江苏出入境检验检疫局．

本标准主要起草人z杨翠云、于翠、闰伟刚、郑建中、印丽萍、李彬．

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I

GB/T28976-2012

草莓潜隐环斑病毒检疫鉴定方法

1范围

本标准规定了草莓潜隐环斑病毒的检疫鉴定方法。－

本标准适用于植物材料，包括元性繁殖材料、种子和苗木中草莓潜隐环斑病毒的检疫鉴定。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注目期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文

件．凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单〉适用于本文件。

SN/T1840植物病毒免疫电镜检测方法

SNIT2122进出境植物及植物产品检疫抽样

3草莓潜隐环斑病毒基本信息

中文名z草莓潜隐环斑病毒

学名：strawberrylatentringspotvirus

缩写：SLRSV

分类地位：Secoviridae科，温州蜜柑矮缩病毒属（Sadwavirus)

草莓潜隐环斑病毒的其他信息参见附录A。

4方法原理

病毒粒子的形态特征、为害症状、血清学特性和分子生物学特征是检疫鉴定该病毒的主要依据，采

用DAS-ELISA、J{下PCR、实时荧光RT-PCR、免疫电镜和鉴别寄主反应等方法进行检疫鉴定。

5仪器设备、设施、用具和试剂

5.1仪器设备

酶标仪、PCR仪、实时荧光PCR仪、超净工作台、电子天平（感量0.001g）、电掠仪、电掠槽、提胶成

像系统、电子透射显微镜、水浴锅、高速玲冻离心机、超低温冰箱（－80℃〉、高压灭菌锅、制冰机、微波

炉、涡旋振荡器。

5.2设施

植物隔离检疫圃，

5.3用具

可调式微量移液器（2µL、10µL、100µL、200µL、1000µL）及相应的元RNase吸头、无RNase离

心管、PCR管、研钵、样品袋、标签、锤子、放大镜等．

5.4试剂

5.4.1除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯或生化试剂．

GB/T28976-2012

5.4.2SLRSV抗体、Trizol、焦碳酸二乙醋（DEPC）、被氨、三氯甲饶、养戊醇、异丙厚、乙醇‘萨琉基乙

醇、AMV反转录酶、TaqDNA聚合酶、DNA相对分子质量标记、漠化乙键、琼脂塘、澳酣蓝等．血清学

和分子生物学撞测试剂配制见附录B.

6症状观察及抽样

6.1症状观察

现场检疫主要观察进境植物材料上病毒为害的症状，SLRSY为害症状描述参见附录A.

6.2抽样

发现有病毒为害症状的植物材料直接送栓；未发现症状的，则按SN/T2122中规定进行抽样，并送

实验室检疫鉴定．

7栓症鉴定

7.1鉴定流程

判定样品中是否携带草莓潜隐环斑病毒，应经过两种或两种以上的栓测方法相互验证。具体操作

流程可参照图1.

病毒奇主植物／样品

RT-PCR

DAS－日，ISA

两种方法检测

两种方法检测

仅一种方法栓测结

结果均为阳性

果为阳性结果将为阴性

样品携带SLRSV样＆不携带SUSY

免疫电镜、撞到tf主屋

应或实时荧光R下PCR

至少一种方法

位测结果均为阴性

检测结果阳性

图1SLRSV鉴定流程固

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7.2双抗体酶联免疫眼附方法（DAS-ELISA)

对种茵、球茎或囱种子催生长出的叶片研磨，并按质量和抽提缓冲液1:10的比例稀释，制备的汁

液分别盛装于l心管中，离心后吸取上清液作为待测样品，并设阳性对照、剧性对照相空白对照．具体

操作步骤见附录c.

7.3RT-PCR方法

植株叶片、种球或种子液氮研细，取o.1g用于提取植物总RNA.具体操作步骤见附录D。

7.4实时荧光RT-PCR方法

植株叶片、种球或种子液氮研细，取0.1g用于提取植物总RNA.具体操作步骤参见附录E.

7.5鉴别寄主测定方法

在栽种于植物隔离检疫圃中的鉴别寄主植物真叶长出后用于摩擦接种，对DAS-ELISA或

RT-PCR检测SLRSV呈阳性的样品加入适量接种缓冲液研磨后接种鉴别寄主．当任意一种鉴别寄主

植物出现如下描述症状时，即可判定接种成功．对接种后表现隐症的鉴别寄主植物，还需要对接种叶片

结合DAS-ELISA或RT-PCR方法验证，如果结果阳性则判定样品携带SLRSV.

a)克色摹（Chenopd叩mamaranticolor）或昆诺黎（Chenopdiumquinoa）：接种叶7d内局部褪绿

或坏死斑，以后是系统褪绿或变形，有时出现坏死或轻微的褪绿斑E

b)菜豆（Phaseolusvuigaris）：接种叶出现局部褪绿或坏死斑5

c)黄瓜（Cucumissativus）：系统感染黄瓜，引起脉间褪绿和坏死，有时无症状z

d)黄花烟（Nicotianarustica）或矮牵牛（Petuniahybrida）：属系统性侵染且无症状出现。

7.6兔瘟电镜方法

利用草莓潜隐环斑病毒抗血清富集植物材料中的病毒，在透视电子显微镜下观察病毒颗桂的形态

特征，具体操作步骤按照SN/T1840规定进行．如观察到直径为30nm的球状病毒粒子，即可判定免

疫电镜结果阳性．

8结果判定

8.1样品经DAS-ELISA或者RT-PCR检测结果为阴性，判定该样品不携带草莓潜隐环斑病毒。

8.2样品经DAS-ELISA栓测为用性，如果RT-PCR结果用性，且序列测定结果证实与所检测的草莓

潜隐环斑病毒一致z或者经实时荧光RT-PCR栓测为阳性时，可判定样品携带草莓潜隐环斑病毒．

8.3样品经DAS-ELISA或者RT-PCR栓测结果为阳性，经免疫电镜观察到病毒颗粒或者接种鉴别寄

主植物出现相应的症状时，可判定样品携带草莓潜酶环斑病毒．

9样品保存与记录结果

9.1样品保存z经检测确定携带草莓潜隐环斑病毒的样品应保存在适合的条件下以备复核．如种子保

存在干燥室温环境中；种苗、鳞球茎等样品保存在一80℃冰箱中，做好登记和标记工作．样品保存期限

至少1年．

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GB/T28976-2012

9.2记录包括：样品来源、种类、取样人员、实验的时间、地点、方糖和结果、检疫员的签字等。酶联免疫

吸附测定法检测应有酶联板反应的数值，生物学测定应有鉴别寄主的症状照片，免疫电镜栓测需要有电