T/GDCA 006-2021 化妆品原料对酪氨酸酶活性抑制试验方法 （体外法）

范围:本文件规定了一种体外酪氨酸酶活性抑制试验方法。 本文件适用于通过抑制酪氨酸酶活性而达到美白效果的化妆品水溶性原料的功效测试; 主要技术内容:1. 实验方法除非另有说明，本文件所提到的受试样品的浓度均指其配制时的浓度。1.1 受试物处理阳性对照曲酸用PBS缓冲液稀释成：0.080 g/L、0.040 g/L、0.020 g/L、0.010 g/L、0.008 g/L、0.005 g/L、0.002 g/L、0.001 g/L系列质量浓度梯度溶液。受试物处理：受试物用PBS缓冲液梯度稀释成5个以上合适质量浓度的样品溶液。1.2 试验分组在96孔酶标板中设置溶剂本底孔（Ta）、溶剂反应孔（Tb）、样品本底孔（Tc）、样品反应孔（Td）。其中，Ta组为溶剂本底组，不加底物L-酪氨酸溶液、不加样品溶液；Tb组为溶剂反应组，加底物L-酪氨酸溶液但不加样品溶液；Tc组为样品本底组，不加底物L-酪氨酸溶液、加样品溶液；Td组为样品反应组，既加底物L-酪氨酸溶液又加样品溶液。每组做三个复孔。1.3 试验步骤参照表1试剂添加量，在各孔依次加入L-酪氨酸溶液、样品溶液/溶剂、PBS缓冲液，充分混匀，置于37 ℃恒温环境下孵育10 min后依次在各孔加入20 μL的酪氨酸酶溶液，37 ℃混匀反应5 min±5 s后即刻放入酶标仪，在475 nm波长处进行测定。注：各孔从加入酪氨酸酶溶液到测定吸光度，保持时间一致（5 min±5 s）。2. 结果计算2.1 酪氨酸酶活性抑制率2.2 半数抑制浓度（IC50 值）以受试样品的浓度为横坐标，其对应的酪氨酸酶抑制率为纵坐标，绘制曲线图，拟合得到回归方程（R2≥0.9）。根据回归方程，计算酪氨酸酶抑制率为50%时对应的样品浓度，即为该受试样品的IC50 值，同时计算其95%置信区间。2.3 曲酸当量值3. 试验有效性验证每批次实验都需要加入阳性对照的测试，阳性对照曲酸的IC50应在0.005 g/L～0.03 g/L，则认为试验系统有效。各组平行孔间的抑制率间的标准差（Standard Deviation，SD）值需≤15%，则认为试验平行性有效。加入酪氨酸酶溶液，37 ℃混匀反应5 min±5 s后即刻放入酶标仪，在475 nm波长处进行测定：±5s时间对测试结果IC50的影响，标准差SD值≤3%。4. 结果判定样品在某一受试浓度下的酪氨酸