DB63/T 1163-2012 牦牛体外受精胚胎生产技术操作规程

ICS65.020.30

B43

备案号：35830-2013DB63

青海省地方标准

DB63/T1163—2012

牦牛体外受精胚胎生产技术操作规程

2012-12-04发布2013-01-01实施

青海省质量技术监督局发布

DB63/T1163—2012

前言

本规程依据GB/T1.1—2009的规则编写。

本规程由青海省畜牧兽医科学院提出并归口。

本规程起草单位：青海省畜牧兽医科学院畜牧研究所。

本规程主要起草人：徐惊涛、孙永刚、才让东智、马志杰。

I

DB63/T1163—2012

牦牛体外受精胚胎生产技术操作规程

1范围

本规程规定了牦牛体外受精胚胎生产的术语和定义、牦牛卵母细胞分级、体外成熟、体外受精及受

精卵体外培养的方法和牦牛胚胎分级。

本规程适用于牦牛体外受精胚胎生产技术推广应用的规范化操作。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB4143牛冷冻精液

GB/T25881牛胚胎

NY/T1674牛羊胚胎质量检测技术规程

3术语与定义

下列术语和定义适用于本规程。

3.1

卵母细胞体外成熟Invitromaturation，IVM

指从活体或离体牦牛卵巢的卵泡中采集未成熟的卵母细胞，在体外进行培养，使之恢复减数分裂到

MII期并具备受精能力的发育过程。

3.2

体外受精Invitrofertilization，IVF

通过人为操作使哺乳动物的精子和卵子在体外环境中完成受精过程的技术。

3.3

体外胚胎生产技术Invitroembryoproduction，IVEP

通过采集牦牛卵母细胞，将之经过体外成熟培养(Invitromaturation，IVM)后与获能的精子进

行体外受精(Invitrofertilization，IVF)，再经过受精卵的体外培养(Invitroculture，IVC)等

一系列过程，在体外生产出可用于移植胚胎的技术。

4试剂、耗材、设备和实验室要求

4.1试剂

1

DB63/T1163—2012

所用的试剂、药品以及要求见附录A。

4.2耗材

所用耗材见附录A。

4.3设备

所用主要设备见附录A。

4.4实验室要求

工作区由准备室、缓冲间、无菌间、细胞保存室组成。其中，缓冲间面积不小于3平方米，并设有

更衣柜和紫外灯。紫外灯管距地面不应超过2.5米，每平方厘米有0.06微瓦能量的照射，每次照射时间

为20分钟~30分钟。无菌室无菌等级的最低标准应达到万级。各种器具的清洗、消毒见附录B。

5卵母细胞采集

5.1活体采卵

借助超声波探测仪直接从活体牦牛的卵巢中吸取卵母细胞。其方法是：直肠把握卵巢，用超声波显

像仪和7.5/5.0兆赫兹阴道扇形探头观察卵巢形态和卵泡位置，使卵泡位于采卵器的进针线上，然后开

启真空泵并推进19号采卵针（长60厘米）对卵泡进行穿刺，将含有卵母细胞的卵泡液抽入集卵杯。采卵

液的配置见附录C。

5.2屠宰后的牦牛卵母细胞的采集

牦牛屠宰后30分钟内从体内摘取卵巢，置于25℃~35℃含青霉素（100单位/毫升）和链霉素（100

微克/毫升）的生理盐水中，2小时内运回实验室，在无菌条件下洗涤卵巢、去除其周围结缔组织后，用

消毒后的纱布或木质纤维纸巾沾干上面的生理盐水并包裹后，使用带18号针头的10毫升一次性注射器从

卵巢内部抽取表面直径2毫米~6毫米卵泡。

5.3牦牛卵母细胞筛选

将收集到的卵泡液转入直径100毫米培养皿中，在实体显微镜下检出卵丘-卵母细胞复合体

（Cumulus-oocytecomplexes,COCs），并按如下方法进行分类，A、B级用于体外受精:

——A级：卵丘细胞层完整而致密、卵母细胞大小正常，细胞质均匀，颜色较暗并充满透明带；

——B级：卵丘细胞不够完整或较松散，层数较少，卵母细胞颜色稍浅；

——C级：卵丘细胞少或膨大变性，卵母细胞颜色浅或裸卵。

6牦牛卵母细胞体外成熟

6.1卵母细胞成熟培养

在直径60毫米无菌培养皿中用卵母细胞成熟培养液制作10个体积为50微升培养滴，覆盖石蜡油后在

CO2培养箱平衡2小时。将收集的A级和B级COCs在成熟培养液清洗3遍后，每15个COCs转入50微升成熟培

养微滴中，置入39℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中成熟培养24小时。卵母细胞成熟培养液的配制见附录C。

6.2卵母细胞成熟的判定

2

DB63/T1163—2012

显微镜下观察培养24小时的牦牛卵母细胞，卵丘细胞膨大扩散，卵母细胞质均匀、没有空泡，用0.1%

透明质酸酶除去卵丘细胞后能见到第一极体（Pb1）为已成熟，否则为未成熟卵母细胞。

7牦牛卵母细胞体外受精

7.1受精微滴制作

在直径35毫米的培养皿中制备50微升IVF微滴，覆盖石蜡油；提前2小时放入39℃、5%CO2饱和湿

度的培养箱中平衡备用。受精液的配制见附录C。

7.2冷冻精液的清洗分离

冷冻精液品质鉴定依据GB4143。细管冷冻精液在37℃温水解冻40秒后，转入Percoll梯度分离液

(45%/90%)中1500转/分钟离心20分钟，弃掉上清液后加入BO工作液（BOworkingsolution）1000转/

分钟离心5分钟，弃去上清液后用血球计数板计算精子数，然后使用BO工作液调整精子浓度为10×106个/

毫升。BO工作液的配制见附录C。

7.3体外受精

每个受精微滴中加入50微升浓度调整后的精液，将成熟培养24小时的牦牛卵母细胞，用BO工作液清

洗两遍后每15个一组移入IVF微滴中，在39℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中受精培养18小时~20小时。

8受精卵培养

受精结束后，将受精卵移入含有200微升培养液的1.5毫升离心管中，在震荡器上震荡40秒去除颗粒

细胞，受精卵用胚胎培养液洗涤3次，每20个受精卵移入已平衡2小时以上、覆盖石蜡油的50微升受精卵

培养微滴中或输卵管上皮细胞共培养微滴中培养，每隔48小时半量更换培养液。受精后48小时统计卵裂

率并吸弃未分裂的卵母细胞，继续培养至第6天-7天，定期观察早期胚胎发育情况。

9胚胎的鉴定和分级

9.1牦牛胚胎的鉴定

9.1.1在20倍~40倍体视显微镜下观察受精卵的形态、色调、分裂球的大小、均匀度、细胞的密度与

透明带的间隙以及变性情况等。胚胎的鉴定主要依据GB/T25881、NY/T1674。

9.1.2凡卵子的卵黄未形成分裂球以及细胞团的、均列为未受精卵。

9.1.3胚胎的发育阶段：

a）桑葚胚（morula）——可观察到球状的细胞团，细胞团占透明带内腔