GB/T 23197-2008 鸡传染性支气管炎诊断技术

犐犆犛１１．２２０

犅４１

中华人民共和国国家标准

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犌犅犜２３１９７２００８

鸡传染性支气管炎诊断技术

犇犻犪狀狅狊狋犻犮狋犲犮犺狀犻狌犲狊犳狅狉犪狏犻犪狀犻狀犳犲犮狋犻狅狌狊犫狉狅狀犮犺犻狋犻狊

犵狇

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２００８１２３１发布２００９０５０１实施

中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局

发布

中国国家标准化管理委员会

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犌犅犜２３１９７２００８

前言

本标准对应于ＯＩＥ《陆生动物诊断试验和疫苗手册》（２００４２．７．６）鸡传染性支气管炎（ａｖｉａｎｉｎｆｅｃ

），其一致性程度为非等效。在此基础上，根据国内科研成果增加了反转录聚合酶链反

ｔｉｏｕｓｂｒｏｎｃｈｉｔｉｓ

应和气管环组织培养血清中和试验，用于病原的鉴定和抗体检测。

本标准的附录为规范性附录，附录为资料性附录。

ＡＢ

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Ⅰ

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鸡传染性支气管炎诊断技术

１范围

本标准规定了鸡传染性支气管炎病毒分离、反转录聚合酶链反应、微量血凝抑制试验以及气管环

组织培养血清中和试验等四种诊断方法的技术要求。

本标准适用于鸡传染性支气管炎的诊断和检疫。

２临床诊断

２．１鸡传染性支气管炎是鸡的一种急性、接触性传染病，临床上有多种表现形式，根据病变类型，可将

其分为：呼吸道型、肾型等，但以经典的呼吸道型发生的最为普遍。

２．２呼吸道型表现为呼吸困难，有罗音或喘鸣音，雏鸡感染可引起死亡。

２．３青年鸡和产蛋鸡感染后，可引起产蛋鸡停产或产蛋下降。表现为产蛋鸡产蛋下降，产软皮蛋、砂壳

蛋或畸形蛋，蛋清稀薄如水。

２．４肾型表现为病鸡排白色稀粪，脱水，死亡率高。

２．５符合上述临床症状之一者，可以怀疑鸡群感染鸡传染性支气管炎病毒，确诊需经实验室检验。

３病原的分离

３．１样品的采集

３．１．１对于急性呼吸道型的病鸡，应采取气管渗出物；对于刚扑杀的病鸡则采取支气管和肺组织。

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３．１．２对于肾型和产蛋下降型的病鸡，应采取发病鸡的肾脏或输卵管。也可从大肠，尤其是盲肠扁桃

体或粪便分离病毒，但从消化道分离到的病毒未必与现流行或发生的病毒有直接关系。

３．２样品的处理

３．２．１将病料放在含有１００００ＩＵｍＬ／青霉素和１０ｍｍＬ／链霉素的Ｈ值为７．４的磷酸缓冲盐水

ｇｐ

（）内，置冰盒内送往实验室。值为的的配方见附录。

ＰＢＳｐＨ７．４ＰＢＳＡ

将病料磨碎，加含抗菌素的制成体积分数为的组织悬液，冻融次，以离心

３．２．２ＰＢＳ２０％３３０００

犵

，取上清液，加入终浓度为／的青霉素和终浓度为／的链霉素，下作用

２０ｍｉｎ１０００ＩＵｍＬ１ｍｍＬ３７℃

ｇ

１ｈ后用于鸡胚接种。

３．３分离培养

取病料上清液，接种于枚日龄日龄的鸡胚尿囊腔内，另枚接种，接种量均

３．３．１５９１１ＳＰＦ５ＰＢＳ

～

为／枚。孵育。每天照蛋，内死亡的鸡胚弃去。收集接种后的鸡胚尿囊液，

０．２ｍＬ３７℃２４ｈ３ｄ７ｄ

～

将所有尿囊液混合，用含／青霉素和／链霉素的稀释倍倍，继续在鸡

１０００ＩＵｍＬ１ｍｍＬＰＢＳ５～１０

ｇ

胚内传代。典型的野毒株通常在鸡胚中传至第代或第代时，可见侏儒胚，传至第代，某些鸡胚可

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出现死亡。含毒尿囊液置－６０℃以下可长期保存，也可以冻干４℃保存。

将分离物经鸡胚传至代或代以上，收获接种后仍存活的鸡胚，取胎儿，用剪刀剪除胎儿

３．３．２３３７ｄ

体外的附属物，并用吸水纸吸干胎儿表面的液体。如接种胎儿重量比对照胚最轻胎儿重量少２ｇ以上

者，可初步判定为有病毒感染。

对病毒的进一步鉴定可通过反转录聚合酶链反应（）进行（见第章）。

３．３．３ＲＴＰＣＲ４

反转录聚合酶链反应（）

４犚犜犘犆犚

４．１核酸抽提

４．１．１材料准备

４．１．１．１被检样品：所采集的病料（肺或肾等组织样品、棉拭子、尿囊液和细胞培养物）应新鲜，或者置

１

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于或低温冰箱保存。

－２０℃－７０℃

４．１．１．１．１组织样品的处理：往１３肺脏或肾脏等组织样品中加灭菌的０．８５％生理盐水研磨成

～

ｇｇ

倍倍悬浮液，反复冻融次次后，以离心，取上清液作核酸抽提用。

５１０２３４０００１０ｍｉｎ

～～ｇ

４．１．１．１．２棉拭子的处理：将棉拭子充分捻动拧干后除去拭子，样品液经离心，

０．５ｍＬ４０００１０ｍｉｎ

ｇ

取上清液作核酸抽提用。

细胞培养物：取细胞培养物反复冻融次次后，以离心后取上清

４．１．１．１．３１ｍＬ２３４０００１０ｍｉｎ

～ｇ

液作核酸抽提用。

阴性尿囊液：日龄鸡胚尿囊液。

４．１．１．１．４１０ＳＰＦ

阳性病毒液：传染性支气管炎病毒株接种日龄鸡胚，孵育后收获的尿囊

４．１．１．１．５Ｍ４１１０ＳＰＦ４８ｈ

液。

４．１．１．２异丙醇。

４．１．１．３灭菌１．５ｍＬ离心管。

４．１．１．４无ＲＮＡ酶（ＲＮａｓｅ）水。

４．１．１．５三氯甲烷（分析纯）。

无水配制的乙醇溶液。

４．１．１．６ＲＮａｓｅ７５％

４．１．２操作方法

４．１．２．１取１００Ｌ４．１．１中的上清液或尿囊液置于一灭菌的１．５ｍＬ离心管中，同时设立阴性尿囊液

μ

或阴性细胞培养液和传染性支气管炎病毒Ｍ４１株阳性病毒液为对照，再分别加入９００Ｌ冰冷的裂解

μ

液，剧烈混合样品１５ｓ，室温放置５ｍｉｎ。

加入三氯甲烷，颠倒离心管混合次，剧烈混合，下以离心。

４．１．２．２２００Ｌ２１０ｓ４℃１００００１５ｍｉｎ

μｇ

吸取上层水相于新的灭菌离心管中，加入异丙醇，放置，

４．１．２．３５００Ｌ１．５ｍＬ５００Ｌ４℃１０ｍｉｎ

μμ

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４℃下以１００００ｇ离心１５ｍｉｎ。

小心弃去全部上清液，加入无水配制的乙醇溶液，上下轻缓颠倒两次，

４．１．２．４１ｍＬＲＮａｓｅ７５％

４℃下以７５００ｇ离心５ｍｉｎ。

４．１．２．５弃去全部上清，风干５ｍｉｎ１０ｍｉｎ，即制得ＲＮＡ。

～

反转录（）

４．２犚犜

４．２．１材料准备

４．２．１．１反转录酶（ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｔａｓｅＸＬＡＭＶ）（），核糖核酸酶抑制剂（ＲＮａｓｉｎ）和反转录引物。

ｐ

反转录引物为个碱基长度的随机引物，序列为（），其中代表或或或四

６５′ｄＮＮＮＮＮＮ３′ＮＡＣＧＴ

个碱基。

４．２．１．２１０ｍｍｏｌＬｄＮＴＰｓ／。

４．２．１．３０．５ｍＬ灭菌ＰＣＲ管。

４．２．２操作方法

在一个洁净的灭菌管中依次加入缓冲液，／

４．２．２．１０．５ｍＬＰＣＲ５×ＡＭＶ２Ｌ１０ｍｍｏｌＬｄＮＴＰｓ

μ

０．５Ｌ，反转录引物２０ｍｏｌ，核糖核酸酶抑制剂（ＲＮａｓｉｎ１０Ｕ），反转录酶ＡＭＶ２．５Ｕ，用无ＲＮａｓｅ水

μｐ

补足总体积２５Ｌ，轻缓混匀。

μ

用中的反转录混合液重悬中制备的，置于室温。

４．２．２．２４．２．２．１４．１．２．５ＲＮＡ１０ｍｉｎ

放入水浴，取出冰浴，所得的反应液即为反转录产物。然后将

４．２．２．３４２℃１ｈ２ｍｉｎｃＤＮＡｃＤＮＡ

置于－２０℃保存或直接做ＰＣＲ。

４．３核酸扩增

４．３．１材料准备

４．３．１．１酶，／，分子质量标准。

犜犪２．５ｍｍｏｌＬｄＮＴＰｓ１００ｂＤＮＡ

狇ｐ

混合引物：包括两对引物（／和／），分别针对传染性支气管炎病毒

４．３．１．２ＰＣＲ４ＰＳＭｓＭｘ３′ｓ３′ｘ

２

／—

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（）基因组的基因及基因组末端的非编码区，这两个基因区间保守性强。在该混合引物中，

ＩＢＶＭ３′

／的引物浓度为／，／的引物浓度为／。引物序列如下：

ＭｘＭｓ４ｍｏｌＬ３′ｓ３′ｘ５ｍｏｌＬ

ｐμｐμ

———：（）；

３′ｓ５′ＧＧＡＡＧＡＴＡＧＧＣＡＴＧＴＡＧＣＴＴ３′２０ｎｔ

———：（）；

３′ｘ５′ＣＴＡＡＣＴＣＴＡＴＡＣＴＡＧＣＣＴＡＴ３′２０ｎｔ

———：（）；

Ｍｓ５′ＣＣＴＡＡＧＡＡＣＧＧＴＴＧＧＡＡＴ３′１８ｎｔ

———：（）。

Ｍｘ５′ＴＡＣＴＣＴＣＴＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣ３′１８ｎｔ

４．３．１．３０．５ｍＬ灭菌离心管。

４．３．１．４２．０％琼脂糖凝胶（含０．５ｍＬ／溴化乙锭），其配制方法见附录。Ａ