T/CVMA 17-2020 新城疫病毒V蛋白抗体间接ELISA检测方法

ICS11.220

B41

团体标准

T/CVMA17-2020

新城疫病毒V蛋白抗体间接ELISA检测方法

IndirectELISAdetectionmethodofnewcastlediseasevirusVprotein

antibody

2020-12-22发布2020-12-22实施

中国兽医协会发布

T/CVMA17-2020

目次

前言I

1范围1

2规范性引用文件1

3术语定义和缩略语1

4原理2

5试验条件2

6试剂2

7仪器和设备3

8样品采集、运输与保存3

9ELISA试验步骤3

10试验数据处理4

11质量保证和控制5

12试验报告5

附录A（规范性）7

附录B（资料性）9

附录C（资料性）10

附录D（规范性）12

附录E（规范性）13

附录F（资料性）15

附录G（资料性）16

附录H（资料性）18

参考文献19

T/CVMA17-2020

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规

则》的规定起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由中国兽医协会提出并归口。

本文件起草单位：华南农业大学。

本文件主要起草人：任涛、徐成刚、廖明、于得水、梁健鹏、谢鹏、向斌、林秋燕。

I

T/CVMA17-2020

新城疫病毒V蛋白抗体间接ELISA检测方法

1范围

本文件规定了鸡血清中新城疫病毒V蛋白抗体间接ELISA检测方法。

本文件适用于鸡群体新城疫病毒V蛋白抗体检测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文本中的规范性引用而构成本文本必不可少的条款。其中，注日

期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包

括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T18936高致病性禽流感诊断技术

GB19489实验室生物安全通用要求

GB/T27418测量不确定度评定和表示

GB/T33087仪器分析用高纯水规格及试验方法

NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范

SN/T2984检验检疫动物病原微生物实验活动生物安全要求细则

YY/T1183酶联免疫吸附法检测试剂(盒)

3术语定义和缩略语

下列术语定义和缩略语适用于本文件。

3.1

新城疫病毒newcastlediseasevirus；NDV

副黏病毒科，副黏病毒亚科，禽腮腺炎病毒属，单股负链RNA病毒。

3.2

酶联免疫吸附试验enzymelinkedimmunosorbentassay；ELISA

指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体特异性结合进行

免疫反应的定性和定量检测方法。

3.3

1

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V蛋白羧基端carboxylterminusofproteinV；Vc

NDVV蛋白是由P基因通过“RNA编辑”的方式插入一个鸟嘌呤编码产生，Vc是指

V蛋白的第101位~240位氨基酸。

3.4

光密度opticaldensity；OD

样品吸收掉的光密度。

3.5

辣根过氧化物酶horseradishperoxidase；HRP

由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白。

3.6

四甲基联苯胺tetramethylbenzidine；TMB

与HRP活性中心反应产生深蓝色沉淀物，起显色剂作用。

4原理

间接ELISA的原理：吸附于固相载体表面的抗原与被检样品中相应的抗体结合形成抗

原抗体复合物，再加入酶标记的抗体（抗抗体），加入底物后，底物被酶催化成为有色产物，

产物颜色的深浅与样品中相应抗体的量呈正比，可根据颜色的深浅进行定性或定量检测。

NDV复制过程中，P基因经RNA编辑作用产生非结构蛋白V。P蛋白与V蛋白氨基端

区域相同，而羧基端区域不同。为保证单一的抗原抗体反应，本方法利用大肠杆菌原核表达

系统表达NDVV蛋白第101位~240位氨基酸的重组蛋白Vc，以其作为抗原建立NDVV蛋

白抗体间接ELISA检测方法。

5试验条件

实验室环境的温度和相对湿度分别为：21℃~25℃，25%~75%。

6试剂

6.1NDVVc蛋白：按照附录A的方法制备，质检结果见附录B和附录C。

6.2阳性血清：按照附录D.1的方法制备。

2

T/CVMA17-2020

6.3阴性血清：按照附录D.2的方法制备。

6.4酶结合物：商品化的HRP标记的抗鸡IgG抗体，工作浓度参照产品说明书。

6.5抗原包被液：按照附录E.1的方法配制。

6.6磷酸盐缓冲液：按照附录E.2的方法配制。

6.7洗涤液：按照附录E.3的方法配制。

6.8稀释液：按照附录E.4的方法配制。

6.9封闭液：按照附录E.5的方法配制。

6.10TMB显色液：按照附录E.6的方法配制。

6.11终止液：按照附录E.7的方法配制。

注：本实验所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T33087的仪器分析用高纯水。

7仪器和设备

7.137℃恒温培养箱

7.2酶标仪

7.3各种规格的微量移液器（200μL和1000μL）和吸头

7.496孔酶标反应板

7.5微量离心管（1.5mL）

7.6一次性无菌注射器（1.0mL）

7.7封板膜

7.8低温离心机

8样品采集、运输与保存

8.1基本要求

按照NY/T541采集、制备、运输和保存鸡血清，按照SN/T2984处理待检鸡，按照GB

19489生物安全相关规定进行检测。

8.2样品采集与运送

用一次性无菌注射器经鸡翅静脉采集血液0.1mL~1mL（按照D.1.2制备），凝固后在

24h内及冷藏条件下送往实验室。若不能及时送往实验室，则应分离血清后，用无菌微量离

心管收集血清，-20℃保存，并在冻结状态下送往实验室。

8.3血清分离与保存

3

T/CVMA17-2020

将凝固血液2000r/min离心5min，用无菌微量离心管收集上清，要求血清无溶血。应

立即用于抗体检测，或置于-20℃保存。

9ELISA试验步骤

9.1抗原稀释

用抗原包被液将NDVVc蛋白稀释至工作浓度1.6µg/mL（见附录F）。

9.2抗原包被

将工作浓度的抗原加入96孔酶标反应板，100μL/孔，贴封板膜，在4℃条件下孵育12

h。

9.3洗涤

倾去孔中液体，用洗涤液洗涤，200μL/孔，洗涤5次，每次室温放置3min，每次洗涤

后于吸水纸上拍干。

9.4封闭

每孔加入200μL封闭液，封板膜封板，置于湿盒中，在37℃条件下孵育2h；洗涤（按

照9.3）。

9.5待检样品及对照血清孵育

待检样品、阳性血清和阴性血清分别与稀释液按1:50稀释（见附录F），加入96孔酶

标反应板，100μL/孔，阳性血清和阴性血清分别设立2个对照；封板膜封板，置于湿盒中，

在37℃条件下孵育1h；洗涤（按照9.3）。

9.6孵育酶结合物

加入酶结合物，封板膜封板，置于湿盒中，在37℃条件下孵育1h；洗涤（按照9.3）。

9.7显色

加入TMB显色液，100μL/孔，室温25℃避光显色10min~15min。

9.8终止显色

至阳性对照呈明显蓝色，阴性对照基本不显色时，加入终止液，100μL/孔。

9.9读数

4

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将96孔酶标反应板置于酶标仪中，以450nm波长测定吸光度OD值。

10试验数据处理

10.1精密度和测量不确定度

精密度和测量不确定度按照GB/T27418测量计算。在同一实验室，由同一操作者使用

相同设备，按相同的测试方法，并在短时间内对同一样品相互独立进行测试获得的2次独立

测试结果OD值的绝对差值不超过5%为前提。

变异系数CV按照YY/T1183计算。参考【S】GPH1-1，当CV＜20%时，精密度为良

好，可进行结果计算。

10.2判定标准

10.2.1阳性结果

当检测样品OD值≥0.293（见附录G）时判为阳性，NDVV蛋白抗体阳性。

10.2.2阴性结果

当检测样品OD值≤0.250（见附录G）时判为阴性。

10.2.3可疑结果

当0.250＜检测样品OD值＜0.293（见附录G）时判为可疑，应重新检测。

11质量保证和控制

11.1实验应设置阴阳性对照从而保证实验的可信性和质量。以阳性血清为阳性对照，OD

值≥0.293时，阳性对照成立；以阴性血清为阴性对照，OD值≤0.250时，阴性对照成立。

11.2所有冷藏试剂用前应室温平衡15min~30min。

12试验报告

试验报告应包含但不限于下列内容，试验报告示例见附录H。

—样品详细信息：包括样品编号、采样日期、采样地点、采样人等；

—试验日期；

—OD值结果；

—异常现象；

—结果判定；

5

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—操作人员信息。

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