NY/T 561-2002 动物炭疽诊断技术

ICS11.220

B41

中华人民共和国农业行业标准

NY/T561-2002

动物炭疽诊断技术

Diagnostictechniquesforanimalanthrax

2002一08一27发布2002一12一01实施

中华人民共和国农业部发布

NY/T561-2002

前言

炭疽是由炭疽杆菌所致的人畜共患烈性传染病，对反当动物危害尤为严重。本病分布于世界各地，

目前很多国家和地区仍有本病的发生，我国个别地区也有散发。世界动物卫生组织W〔orldOrganization

forAnimalHealth(英),OfficeIntentionaldesEpizootic(法),OIE]将该病列为B类动物传染病，我国农

业部将其规定为二类动物传染病。

本标准与OIE编著《哺乳动物、禽和蜜蜂A和B类疾病诊断试验和疫苗标准手册》(2000)中有关炭

疽抗原的诊断技术基本一致。但该手册介绍的血清学试验，由于特异性和敏感性较差而未采用。本标准

吸收了农业部1979年颁布的皮《张炭疽沉淀反应技术操作规程》和《荧光抗体检验撰、毛、绒类炭疽杆菌

操作规程》等部分内容，因此，在本标准实施之后，上述规程将自动废止。

本标准的附录A,附录B为规范性附录。

本标准由农业部畜牧兽医局提出。

本标准由全国动物检疫标准化委员会归口。

本标准起草单位:中国人民解放军军需大学。

本标准主要起草人:王世若、王兴龙、沈广、韩文瑜、梁焕春。

NY/T561-2002

动物炭疽诊断技术

1范围

本标准规定了动物炭疽杆菌分离培养鉴定及血清学试验方法。

本标准适用于各种动物炭疽病的诊断及检疫。

2新鲜疑似炭疽病料标本的细菌学检查

2.1显微镜检查

2.1.1材料准备

2.1.1.1器材

恒温箱、显微镜、高压灭菌器、煮沸消毒器、漏斗、15mmX150mm试管、最小反应管、移液管、带胶

乳头的毛细吸管(或血清加样器)、乳钵、中性石棉、5ml一注射器、外科刀、镊、铂金耳、酒精灯等。

2.1.1.2培养基

戊烷眯多粘菌素血液琼脂平板、碳酸氢钠琼脂平板、快速增殖肉汤、普通营养肉汤、普通营养琼脂平

板、2%绵羊血液琼脂平板、2%兔血清琼脂平板等，配制方法见附录Ao

2.1.1.3试剂

炭疽沉淀素血清、阴性血清、标准炭疽杆菌抗原、炭疽荧光抗体、炭疽噬菌体。

2.1.1.4溶液及染色液

克氏固定液、磷酸盐缓冲盐水(PBS),缓冲甘油、0.5%苯酚(俗名石炭酸)溶液、福尔马林龙胆紫染

色液、碱性美蓝染色液、革兰氏染色液，配方见附录Be

2.1.1.5实验动物

体重17g-20g清洁级昆明系小鼠。

2.1.2病料标本采集

疑为炭疽动物，除慢性者外，其他不论是最急性者或急性者均于生前将耳部消毒后取血液，病变部

取水肿液或渗出液等直接涂于载玻片上，自然干燥后，将玻片涂面相对叠好，中间用火柴杆隔开，以线拥

扎，外用塑料纸包好。或用灭菌脱脂棉、滤纸、布片吸取血液等放于小试管中.待检。

死后，自消毒的耳根部或四肢末端部采取血液滴于玻片上;或用细绳在耳根部紧扎两道，在两绳之

间将耳割下，以5%苯酚溶液(见第B-8章)浸湿的棉布包好，放广口瓶中待检，耳切口处用烧红的烙铁

烧灼止血。已经错剖的疑似炭疽动物尸体，可取肝、脾、肾等脏器置于试管中，待检。

上述涂片自然干燥，火焰固定，如涂片较薄，也可用无水甲醇或乙醇固定，然后用下述染色法染色

镜检。

2.1.3窗比格尔(Ribiger)氏英膜染色法

2.1.3.1操作方法

滴加。.5ML-1.0ml福尔马林龙胆紫染色液(见第B.5章)于涂抹面上，染色2s-5s，水洗(冲洗

水用次氯酸盐溶液消毒，余同)、干燥、镜检。

2.1.3.2结果观察

粗大菌体呈竹节状排列，染成深紫色，菌体周围的荚膜染成淡紫色。

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2.飞.4碱性美蓝染色法

2.1.4门操作方法

滴加0.5m1一1.0nit碱性美蓝染色液(见第B.e章)于涂抹面上，染色2min-3min.水洗、一干燥、

镜检

2.1.4.2结果观察

粗大菌体呈竹P状排列，染成深蓝色，菌体周围的荚膜染成粉红色。也可用3%沙黄染色液染色

3min-5min,菌体染成红色，菌体周围的荚膜染成黄色

如观察到以上形态特征的杆菌，可初步确定为炭疽杆菌。

2.1.5荧光抗体染色法

2.1.5.1取样.涂片

以无菌手续采取可疑病变组织、水肿液、血液或渗出液等材料制成涂片标本，待检。

2门.5.2染色方法

染色方法如下:

。)将制备好的涂抹玻片，自然十燥。

}))将玻片投人克氏固定液内，固定15min，再经外%酒精略加漂洗，自然干燥。

c)滴加炭疽荧光抗体血清(见2.1.工，3)0.5nil~工。m工浸没涂片，放湿盒内，室温孵育

20min-30min.

d、用磷酸盐缓冲盐水(PBS)(见第B.2章)冲去荧光抗体，并于同一磷酸盐缓冲盐水内浸泡

3mm-5mm，冉经蒸馏水略加漂洗，自然十燥

。)加适量缓冲甘油(见第B.3章)，封片，荧光显微镜检查。

2-，.53检查结果

洲:菌体周围的芙膜肥厚，发闪亮的黄绿色荧光，中央菌体呈明显或不明显的橙红色。

川:菌体周围的荚膜肥厚，发明亮的黄绿色荧光，中央菌体呈明显或不明显的橙红色。

料M(体周围的英膜肥厚，发较弱的黄绿色荧光中央菌体呈明显或不明显的橙红色。

+:荚膜不显著，黄绿色荧光暗淡，中央菌体呈明显或不明显的橙红色。

一:无黄绿色荧光

荧光反应在“干衬，号以上者，报告发现了炭疽杆菌

2.2分离培养检查

炭疽杆菌的培养性状具有特征性，是确诊的重要依据之一，但病畜病程短，故分离培养检查主要用

于动物死后新鲜标本的检验

2.2.1操作方法

用铂金耳钓取血液、水肿液、渗出物等，直接涂于平板培养基表面;脏器标本应切成几个不同的断

面，压印于一平板表面卜，置37C恒温箱中孵育18h-24h

2.2.2培养结果

如观察到以下特征的菌落，符合炭疽杆菌的特征

。)普通营养琼脂平板(见第A.5章)形成扁平、灰白色、毛玻璃样、粗糙、表面干燥、边缘不整齐、

肖径约3mm-5mm的火焰状大菌落。用低倍显微镜观察菌落边缘，早卷发状培养物有粘

性，月J铂金耳钓取，可拉成长丝，称为“拉丝状”现象

b)2%绵羊血液琼脂平板(见第A.1章)菌落周围不溶血，超过24h,发生轻度不完全溶血。

。)戊烷眯多粘菌素血液琼脂平板(见第A.1章)其他需氧芽胞杆菌不生长，但炭疽杆菌生长，仅

受轻度抑制，月菌落生长缓慢，于15h-24h，形成较小的毛玻璃样粗糙的菌落，其边缘仍保持

卷发状、不溶血

2.3分离的可疑菌株鉴定

用铂余耳钓取可疑菌落接种于普通营养肉汤中(见第A.4章)增菌，在37C水浴箱中孵育4h-

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5卜，再钓菌进行下述形态特征、培养特性及抗原性鉴定

2.3.1形态特征

2.3门门革兰氏染色(见第B.7章)镜检。

2.3.1.2检查结果:见到粗大菌体，长3pm^5pm，宽。.1pm-v1.2Iim.中央椭圆形芽胞，长链条排

列，两菌接触端如刀切状，革兰氏阳性。可判为炭疽杆菌。

2.3.2培养特性

2.3.2.1普通营养肉汤

管底有白色棉絮状沉淀物，培养液澄清，轻摇试管，沉淀物卷绕成团，往上升起，但不散失

2.3.2.2青.素串珠试验和青.素抑制试验

用铂金耳钓取待鉴定的培养物于2%兔血清琼脂平板(见第A.7章)上，以灭菌的I，形曲玻璃棒将

菌液在平板表面上涂匀，用小镊子夹取浸有每毫升含50IU-100IU青霉素直径6mm小纸片，贴于平

板培养基中央，置37C恒温箱中孵育3h-4h，取出，打开平皿盖，平放在显微镜载物台上，用低倍及高

倍显