DB34/T 2071-2014 杂交玉米及亲本真实性鉴定DNA分析方法

ICS67.060

B22

DB34

安徽省地方标准

DB34/T2071—2014

杂交玉米及亲本真实性鉴定DNA分析方法

IdentificationofgenuinenessofhybridcornanditsparentsusingDNAanalysis

method

2014-02-17发布2014-03-17实施

安徽省质量技术监督局发布

DB34/T2071—2014

前言

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。

本标准由安徽省质量技术监督局提出，安徽省农业标准化技术委员会归口。

本标准起草单位：安徽省农业科学院水稻研究所。

本标准主要起草人：陆徐忠、杨剑波、倪金龙、刘勋辉、李莉、汪秀峰、马卉、张小娟。

I

DB34/T2071—2014

杂交玉米及亲本真实性鉴定DNA分析方法

1范围

本标准规定了杂交玉米及亲本品种真实性鉴定SSR分子标记法的术语和定义、原理、试剂与溶液、

主要仪器、操作步骤和结果判定。

本标准适用于玉米单交种和自交系的品种真实性鉴定。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T3543.2农作物种子检验规程扦样

GB/T3543.4农作物种子检验规程发芽试验

GB4404.1粮食作物种子第1部分:禾谷类

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

品种真实性varietalgenuineness

供检品种与文件记录(如标签等)是否相符。本标准中指品种间在DNA分子标记带型上的一致性。

3.2

标准样品standardsample

经权威机构认定认证的代表已知品种特征特性的样品，对有性繁殖作物而言，一般为种子。

4原理

根据SSR序列两端保守的单拷贝序列设计特异引物，利用PCR技术扩增每个位点的重复次数，通

过电泳分析其长度多态性，进行杂交玉米及亲本的真实性鉴定。

5试剂与溶液

5.1仅使用分析纯试剂和符合GB/T6682规定的一级水。

5.2β-巯基乙醇

1

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5.3异丙醇

5.4剥离硅烷

5.5四甲基乙二胺（TEMED）

5.6TaqDNA聚合酶

5.7PCR反应缓冲液（10×Buffer）

5.825mmol/L氯化镁溶液（MgCl2）

5.9DNA分析仪专用丙烯酰胺胶液

5.10DNA分析仪专用分子量内标

5.11DNA分析仪专用电泳缓冲液

5.121mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液（Tris-Hcl）：称取121.1g三羟甲基氨基甲烷（Tris）

溶解于800mL水中，用盐酸（HCl）调pH至8.0，加水定容至1000mL。在103.4kPa（121℃）条

件下灭菌20min，4℃储存。

5.1310mol/L氢氧化钠溶液（NaOH）：在160mL水中加入80.0g氢氧化钠（NaOH），溶解后，冷

却至室温，再加水定容到200mL。

5.140.1mol/L氢氧化钠溶液：2g固体氢氧化钠溶于450mL水中，加水定容至500mL。

5.150.5mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液（EDTA-Na2）（pH8.0）：称取187.6g乙二铵四乙酸二钠

（EDTA-Na2）加入800mL水中，再加入适量氢氧化钠溶液，加热至完全溶解后，冷却至室温，用氢氧

化钠溶液调pH值至8.0，加水定容至1000mL。在103.4kPa（121℃）条件下灭菌20min，4℃储存。

5.16十六烷基三甲基溴化铵提取液（CTAB）：81.7g氯化钠和20g十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）

溶于800mL水中，然后加入1mol/LTris-HCl100mL，0.5mol/LEDTA-Na240mL，定容至1000mL，

4℃贮存。

5.17TE缓冲液1：1mol/l三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液5mL，0.5mol/lEDTA-Na21mL，加HCl

调pH至2.0，加水定容至500mL。

5.18TE缓冲液2：1mol/l三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液5mL，0.5mol/lEDTA-Na21mL，加HCl

调pH至8.0，加水定容至500mL。

5.19氯仿+异戊醇混合液：体积比为24+1。

5.2070％乙醇：量取70mL无水乙醇，加水定容至100mL。

5.21SSR引物工作液：SSR标记序列信息参见附录A。用一级水分别配制终浓度均为20μmol/L的上、

下游引物工作液。

5.22dNTPs混合溶液：浓度为2.5mmol/L的dNTPs混合溶液。

5.235×Tris/硼酸电泳缓冲液（5×TBE）：分别称取50g三羟甲基氨基甲烷、27.5g硼酸溶于500mL

水中，加入10mL0.5mol/LEDTA-Na2溶液，定容至1000mL,4℃储存。

5.24加样缓冲液：在98mL去离子甲酰胺中加入250mg溴酚蓝（BromophenolBlue）、250mg二甲

苯氰（XyleneCyanoleFF）、2mL0.5mol/LEDTA-Na2，溶解混匀，常温保存。

5.25亲和硅烷工作液：在1mL无水乙醇中加入5μl亲和硅烷原液，混匀。

5.266％变性聚丙烯酰胺溶液：称取57g丙烯酰胺、3g甲叉双丙烯酰胺、420g尿素溶于200mL

水中，加入200mL/L5×TBE，室温充分溶解后，定容至1000mL，4℃储存。丙烯酰胺具神经毒性，配

制时应注意防护。

5.2710％过硫酸铵溶液：称取10g过硫酸铵溶于100mL水中，4℃储存。

5.281％硫代硫酸钠：称取1g硫代硫酸钠，溶于100mL水中，室温储存。

5.29固定液：在89.5mL水中加入10mL水无水乙醇，0.5mL冰醋酸，根据胶板数量调整固定液的

量，现用现配。

5.30染色液：在100mL水中加入0.2g硝酸银（AgNO3），根据胶板数量调整染色液的量，现用现配。

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DB34/T2071—2014

5.31显影液：在100mL水中加入1.5gNaOH和0.4mL甲醛(37％)，现用现配。

6主要仪器

6.1PCR扩增仪。

6.2台式高速冷冻离心机：最大离心力≥10,000g，温控范围最-10℃～40℃。

6.3电泳检测系统：垂直电泳系统、毛细管电泳系统。

6.4单道微量移液器：2.5μL、10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL。

6.5多道微量移液器：8道或12道，10μL、100μL、300μL。

6.6酸度计：精度±0.01pH。

6.7电子天平：可读性为百分之一、万分之一。

6.8胶片观察灯。

6.9脱色摇床。

7操作步骤

7.1试样制备

以受检样品所标注品种的标准样品作为对照，同时检测受检样品和标准样品。受检样品和标准样品

可为棉花的种子、幼嫩叶片等。

样品纯度应符合GB4404.1的规定，种子扦样按GB/T3543.2规定执行，种子发芽按GB/T3543.4

规定执行（幼苗长度达3cm左右用于制备PCR模板）。

7.2PCR模板制备

分别从受检样品和标准样品中随机抽取5粒种子或单株，根据实际情况从以下两种方法中选择任

一方法制备模板DNA。

7.2.1碱裂解法

幼苗或幼嫩叶片，每株取1.5cm长，剪碎；干种子直接剥取胚。将样品按单株分别放入96孔板

中，每孔加入100μL氢氧化钠提取液及1μLβ-巯基乙醇，沸水加热5min，然后每孔再分别加入100

μLTE缓冲液1，直接取2μL作为模板进行PCR扩增。

7.2.2CTAB法

取幼苗或幼嫩叶片约200～300mg，置于2.0mL离心管，加液氮充分研磨，或取种子充分磨碎，

移入2.0mL离心管；每管加入700µL65℃预热的CTAB提取液后，充分混合，65℃保温60min，

期间多次颠倒混匀；每管加入等体积的三氯甲烷+异戊醇混合液，充分混合后，静置10min；12,000rpm

离心15min后，吸取上清液至一新离心管，再加入等体积预冷的异丙醇，颠倒离心管数次，在-20

℃放置30min；4℃，12,000rpm离心10min，弃上清；加入70％乙醇，旋转离心管数次，弃去乙

醇；将离心管倒立于垫有滤纸的试验台上，室温干燥沉淀6h以上；加入100µL超纯水或TE缓冲

液2，充分溶解后备用。

7.3PCR扩增

利用40对核心引物（见附录A）对受检样品和标准样品DNA进行扩增。

3

DB34/T2071—2014

7.3.1PCR扩增反应体系

在PCR反应管中按表1依次加入反应试剂，混匀。

表1PCR扩增反应体系

反应组分原浓度终浓度推荐反应体积（20L）

10×缓冲液10×1×2.0

MgCl225mmol/L2.5mmol/L2.0

dNTPs2.5mmol/L每种0.15mmol/L每种1.2

Tag酶5.0U/L1.0U0.2

引物20mol/L每种0.25mol/L每种0.25

PCR模板－*－*