DB37/T 3104-2018 向日葵杂交种品种纯度SSR分子检测标准

ICS67.060

B21

DB37

山东省地方标准

DB37/T3104—2018

向日葵杂交种品种纯度SSR分子检测标准

ThevarietypurityidentificationtechniqueofsunflowerseedswithSSR

2018-02-02发布2018-03-02实施

山东省质量技术监督局发布

DB37/T3104—2018

前言

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。

本标准由山东省农业厅提出。

本标准由山东省农业标准化技术委员会归口。

本标准主要起草单位:山东农业大学、北京德农种业有限公司。

本标准起草人：张春庆、赵洪春、郑建鹏、温大兴、李岩。

本标准为首次发布。

I

DB37/T3104—2018

向日葵杂交种品种纯度SSR分子检测标准

1范围

本规程规定了SSR分子检测向日葵种子纯度的试剂配比、DNA提取、SSR引物选择、多重PCR方法、PCR

产物检测等技术要求。

本规程适用于向日葵品种和杂交种种子纯度的室内快速鉴定。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB3543种子检验技术规程

GB20464农作物种子标签通则

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

杂交种

各种直接用于生产的杂交向日葵一代种子。

3.2

品种纯度

品种在特征特性方面典型一致的程度，用本品种的种子数占供检本作物样品种子数的百分率表示。

3.3

标准样品

能够充分代表种或品种特征特性的种子样品，或具备指定特征、特性样品。

3.4

引物

一条互补结合在模板DNA链上的短单链，能提供3’-OH末端作为DNA合成的起始点，延伸合成模板DNA

的互补链。

4原理

1

DB37/T3104—2018

从向日葵种子中提取DNA，利用SSR引物进行PCR扩增，不同碱基长度的PCR扩增引物通过聚丙烯酰胺

凝胶电泳分离，并通过染色显示DNA指纹谱带类型。不同向日葵品种由于遗传组成不同，基因组中DNA

简单重复序列的重复次数有差异，这种差异可通过PCR扩增、电泳、染色程序获得的DNA指纹图谱加以区

分，从而对不同品种进行鉴定。杂交种纯度鉴定时，可从附表中选取亲本有差异的SSR引物。品种纯度

鉴定时，从附表中选择生产上常用品种间有差异的引物。

5仪器与试剂

5.1仪器

电子天平，水平摇床，双垂直板电泳槽，PCR仪，电泳仪，高压灭菌锅，观片灯。

5.2试剂

丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、谷氨酸、乙二胺四乙酸二钠、硼酸、过硫酸铵、四甲基乙二胺（TEMED）、

氢氧化钠、氢氧化钾、甲醛、2×PowerTaqPCRMasterMix、超纯水、SSR引物、硝酸银（所用试剂

均为分析纯，所用水均为去离子水)。

6溶液

6.1提取液

称取0.56g氢氧化钾于100mL烧杯中，加去离子水溶解并定容至100mL，4℃贮存备用。

6.230%凝胶溶液

称取292g丙烯酰胺于1000mL烧杯中，加去离子水溶解，再加入8g甲叉双丙烯酰胺，溶解后定容

至1000mL，4℃贮存备用。

6.35×TBE

称取54gTris、3.72g乙二胺四乙酸二钠、27.5g硼酸于1000mL烧杯中，溶解后定容至1000mL。

6.4催化剂

称取10g过硫酸胺于100mL烧杯中，加去离子水溶解并定容至100mL，4℃贮存备用。

6.5电极缓冲液

取5×TBE200mL，用去离子水定容至1000mL。

6.6染色液

称取1g硝酸银溶于500mL去离子水中。

6.7显色液

称取10g氢氧化钠溶于500mL去离子水中，用时加2mL甲醛。

7操作程序

2

DB37/T3104—2018

7.1DNA提取

从送验样品中随机数取向日葵种子200粒，将种子剥壳后纵切，放入1.5mL离心管中，加入300μL

提取液，提取时间1min～24h均可，使用前混匀、静止5分钟、离心3000rpm，0.5min，取上清即为

DNA样品，用于PCR扩增时DNA样品模板量为2μL。

7.2扩增体系

采用20μL扩增体系，其中每对U-primers的上下游引物(10μM)各0.5μL，2μL25mmol/LMgCl2，

0.2μL5U/μLTaq酶，2μL10×PCRBuffer，2μLDNA提取液，用灭菌后的超纯水补足20μL。

7.3多重PCR扩增程序

通用多重PCR扩增程序采用“两段循环模式”：

a)预变性(94℃，5min)；

b)第一段循环(循环数：3)命名为“逐一退火循环”：变性(94℃，40s)；按照未加通用接头前

的多对引物的退火温度从高到低的顺序逐一退火，每个退火温度的退火时间为20s；延伸

(72℃，30s)；

c)第二段循环(循环数：28～32，通常为30个循环)：变性(94℃，40s)；将退火和延伸过程合

并(70℃，50s)；

d)终延伸(72℃，10min)。引物选择参考附表，每个杂交种选择3～5对亲本有差异的引物扩增。

7.4扩增产物检测

可用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，也可用高通量检测设备，对PCR产物进行检测。聚丙烯酰胺凝胶电

泳检测程序如下。

7.4.1凝胶制备

将洗净晾干的玻璃板采用水平平板灌胶的方式组装玻璃板，用铁夹固定，取20mL5×TBE，30mL

30%Acr，50mL去离子水于烧杯中，加800uL～1000uL的10%APS，80uL～100uLTEMED混匀，灌

入板中，插入梳子，10min左右聚合，拔出梳子，吸取多余的水，装板。

7.4.2点样

用微量移液器取2ul体系加入样品槽，每加一个样品后，清洗移液器两次，区分不同引物加marker。

7.4.3电泳

加样完毕后，加入电极缓冲液，上槽电极缓冲液要没过矮玻璃板，下槽电极缓冲液要没过玻璃板，

将电源线正极接下槽，负极接上槽。接通电源，180V稳压电泳2.5h。

7.4.4卸板、染色、显色

倒出电极液，卸开电泳槽并用油灰刀取出胶片，将胶放入去离子水中水平摇床1min，倒掉去离子

水，加入染色液硝酸银，水平摇床2min～3min，倒掉，加入去离子，水水平摇床1min，倒掉，加入

显色液500ml（2%氢氧化钠，用时加入甲醛2ml），水平摇床至显色为止，倒掉显色液，加入去离子

水水平摇床1min。

7.4.5谱带分析

3

DB37/T3104—2018

待整个供检样品电泳结束后，鉴定凝胶胶片上电泳谱带的一致性。对检测的SSR引物双亲谱带同时

出现的为本品种，只有某一亲本谱带为亲本，谱带与双亲位置有差异的籽粒为杂粒。

8结果计算

计数供检样品粒数（N）和非本品种粒数（M），并按式计算电泳测定值X%（保留一位小数）。

X（%）=（N-M）/N×100

9结果报告

按照GB/T3543，写明对照样品名称，使用的亲本有差异的引物数量，检测粒数，纯度%。对送样样

品的检验需注明：“结果仅对样品负责”；监督检验时，需注明：“结果对种子批负责”。

4

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AA

附录A

（规范性附录）

引物及其参数

表A.1规定了标准中引物及其参数。

表A.1引物及其参数

引物名称序列(5'to3')Tm退火温度

ORS928-FCATGGTTATTTTGGTTTGGGTTT54.8

54

ORS928-RGCTATTATCATGTCCTTGTCCTTTT57.1

ORS613-FGTAAACCCTAGGTCAATTTGCAG58.4

55(+2、+1)

ORS613-RATCTCCGGAAAACATTCTCG55.8

ORS543-FCCAAGTTTCAGTTACAATCCATGA56.8

56

ORS543-RGGTCATTAGGAGTTTGGGATCA58.2

ORS694-FCCTGGAACTGAACCGAGAAC59.8

59(-1、+1、+2)

ORS694-RGCCGTGAAACAGAGAGAGGA59.8

ORS956-FGGACCAGATTGCTTCCTAGACTT60.2

54

ORS956-RTCAACATGCGTGATTATTGTTTG54.8

ORS483-FCCGAACAACAATCTCCACAA55.8

55

ORS483-RGGTTTAGGTGTCGCATCACA57.8

ORS925-FATGATTCTAAGTTGCGGTAGTGC58.4

57

ORS925-RGTTGGGTTTAAGTTGTTGCTTCC58.4

ORS1025-FGACATGGCTTGAACATTTGATTA54.8

54

ORS1025-RTCTTATATGCACATCAGTACAAGTCTC59.0

ORS1021-FAACCCTAATCCAACCAGATACGA58.4

57

ORS1021-RTACCACCAGCTCATCCTTAACCT60.2

ORS1079-FTACGACTGACGATTCCATTTCTC58.4

57

ORS1079-RAACTGGATTTCACAGGGAGTGTT58.4

ORS1256-FGATGTTGATGTTGGTGAAGTTGC58.4

57

ORS1256-RCTCCGTCACCTTAAGCACTTGTA60.2

ORS409-FTCCCAGACTAGAGATCGACCA60.0

57

ORS409-RAAACTCAAGGGACTAAGGTTGC58.2

ORS1108-FACCACACTTATCCAAAGGTTTAAGG58.7

58（-1）

ORS1108-RCGTGAGAGTAGTTACGAGAAGGAGA62.0

5

DB37/T3104—2018

表A.1引物及其参数(续)

引物名称序列(5'to3')Tm退火温度

ORS727-FGGTGGCAAGTGGTGGTTAGA59.8

57

ORS727-RAAAGCTGGTCATCTCAAGGGTA58.2

ORS801-FCCATCTTGGACGCACATCTA57.8

57

ORS801-RGAACCACCCGATCATATCCA57.8

ORS366-FAACCAACTGAGCATTCTTGTGA56.3

55

ORS366-RGCGCTAGGTTAAAGAGGACAAA58.2

ORS331-FTGAAGAAGGGTTGTTGATTACAAG56.8

55

ORS331-RGCATTGGGTTCACCATTTCT55.8

ORS1065-FACCGCTGTCAACACCTTAAACTC60.2