GB/T 29394-2012 柑桔溃疡病菌的检疫检测与鉴定

ICS65.020.01

B16GB

中华人民共和国国家标准

GB/T29394-2012

柑桔溃殇病菌的检疫检测与鉴定

DetectionandidentificationofXanthomonasaxonopodispv.Citri

2013-06-01实施

2012-12-31发布

中华人民共和国国家质量监督检验检蔑总局也士

中国国家标准化管理委员会QC..,.J

GB/T29394-2012

前言

本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。

本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271)提出并归口。

本标准起草单位z全国农业技术推广服务中心、四川省植物检疫站、重庆大学。

本标准主要起草人z王福祥、宁红、谭家兴、项字、郭迪金、王中康。

I

GB/T29394-2012

柑桔溃殇病菌的检疫检测与鉴定

1范围

本标准规定了柑桔溃茄病菌（Xanthomonasaxonopodispv.Citri）的田间症状和实验室病原形态

鉴定、免疫学和PCR检验的技术要求。

本标准适用于芸香科植物检疫中柑桔溃荡病菌的检测和鉴定。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单〉适用于本文件。

GB/T5040-2003柑桔苗木产地检疫规程

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

显症植株diseasedplant

受柑桔溃窃病菌侵染，并已经表现症状的寄主植物。

3.2

无症带菌植株踊ymptomaticplant

受柑桔溃茄病菌侵染，但并没有表现症状的寄主植物。

3.3

疑似症状suspiciousI四ion

部分符合柑桔渍茹病典型症状描述或与典型症状描述相近似的症状。

4柑桔溃萄病菌基本信息

中文名z柑桔溃荡病菌。

学名：Xanthomonasaxonopodispv.CitriVauterinetal1995。

异名：X.campestrispv.Citri(Hasse)Dye19780

病害英文名：citruscanker,Bacterialcankerofcitrus。

属于黄单抱杆菌科，黄单抱杆菌属。

柑桔愤荡病远距离传播主要是通过人为的引种，商品的流通。带病苗木、接穗和果实等繁殖材料是

该病传播的载体。田间传播则是通过风雨、昆虫和农事操作等。

柑桔溃荡病菌的相关资料参见附录Ao

5方法原理

对于已形成柑桔溃荡病典型症状样品，由于典型症状易识别，且近似症状的病原菌为真菌（参见附

GB/T29394-2012

录B），通过菌溢检查和革兰民染色法，可直接进行鉴定；对于有疑似症状的样品，通过病原分离培养和

接种试验可进行检验鉴定z间接ELISA检验主要用于疑似症状、不显症样品的检验鉴定；PCR检验主

要用于以上两种方法均不能确定时的检验鉴定，有条件的实验室也可直接用于疑似症状、不显症植株的

检验鉴定。

6仪器及用具

6.1症状及病原形态鉴定仪器及用具

天平、高压灭菌锅、超净工作台、培养箱、生物显微镜、体式显微镜、解剖刀、接种棒、培养皿、烧杯、载

玻片、盖玻片、吸管等。

6.2ELISA检测仪器及用具

天平、高速台式离心机、打孔器、微量移液器一套、移液器、酶标板、酶标仪等。

6.3PCR栓测仪器及用具

高速台式离心机、PCR扩增仪、PCR反应管、水平电泳仪、凝胶成像系统、微量移液器一套。

7试剂及材料

除非另有说明，在本标准中仅使用确认的分析纯试剂和蒸锢水或去离子水或相当纯度的水。

7.1症状及病原形态栓测试剂与材料

7.1.1元菌水HzO.

7.1.2革兰氏染色液。

7.1.3蔚糖蛋白陈培养基PSA.

7.2ELISA栓验试剂与材料

7.2.1样品提取液z取1.15g磷酸氢二铀（Na2HPO.）、0.2g氯化饵（KCl)、0.2g磷酸二氢饵（KH2P04),8g

氯化铀（NaCl)、0.2g叠氮化纳（NaN3），用1000ml.蒸锢水溶解，并调整pHf直到7.4。

7.2.2洗涤液2取1.15g磷酸氢二铀（Na2HP04）、0.2g氯化饵（KCD、0.2g磷酸二氢御（KH2PO.）、

8g氯化铀（NaCD、0.5g吐温－20，用1000mL蒸懵水溶解，并调整pH值到7.4。

7.2.3封闭液z取5g元脂奶粉，用100mL样品提取液溶解。

7.2.4包被液z取2.93g碳酸氢铀（Na2HC03）、1.59g氯化饷（NaCl)、0.2g叠氮化铺（NaN3），用

1000mL蒸馆水溶解，并调pH值到9.6.

7.2.5抗体稀释液：取2.5g脱脂奶粉、加100mL洗涤液溶解。

7.2.6抗体z兔抗柑桔溃荡病菌抗体球蛋白。

7.2.7酶标抗体z市售碱性磷酸酶标记的羊抗兔抗体球蛋白。

7.2.8底物缓冲液z用80mL灭菌蒸馆水将0.01g氯化镜（MgCl2•6H20）、o.02g叠氮化铀

(NaN3）、9.7mL二己醇胶（CH2CH20H）溶解后，调pH值Jlj9.8，定容到100mL。

7.2.9底物溶液z将5mg对硝基苯磷酸盐（CsHsN03）溶解于5mL底物缓冲液中．底物禧液制备需

在孵育结束前10min内，避光条件下制备。

7.2.10终止液z将12g氢氧化销（NaOH），用100mL蒸馆水溶解。

GB/T29394一2012

7.3PCR栓验试剂与材料

7.3.1灭菌超纯水ddH20o

7.3.2PCR缓冲液［×10］。

7.3.3引物（primer):

上游引物CXAcF):5'-ACGAGAAAGAACTTCGCCCC-3';

下游引物（XAcR):5'-TCTGACCACATCGCATAGGA-3＇；用双蒸水稀释至50µmol/L

7.3.4dNTP[25mmol/L]"

7.3.5MgCl2[25mmol/L]a

7.3.6Taq