GB/T 29431-2012 番茄溃疡病菌检疫鉴定方法

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B16

中华人民共和国国彖标准

GB/T29431—2012

番茄溃疡病菌检疫鉴定方法

DetectionandidentificationofClavibactermichiganensissubsp.

michiganensis(Smith)Davisetal.

2012-12-31发布2013-06-01实施

GB/T29431—2012

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本标准按GB/T1.1-2009给出的规则起草。

本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。

本标准起草单位：中华人民共和国珠海出入境检验检疫局、华南农业大学、中国农业大学、中华人民

共和国北京出入境检验检疫局。

本标准主要起草人:乐海洋、彭仁、刘琼光、罗来鑫、张建军、刘勇、冯欣、龚忠年、林友伟、张卫东、

高文娜。

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GB/T29431—2012

番茄溃疡病菌检疫鉴定方法

1范围

本标准规定了番茄溃疡病菌的检疫鉴定方法。

本标准适用于番茄种子、苗木等相关茄科植物材料中番茄溃疡病菌的检疫和鉴定。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样

3番茄溃疡病菌基本信息

中文名：番茄溃疡病菌（密执安棒形杆菌密执安亚种）。

学名:Clavibactermichi^afierisissubsp.michi^anensis（Smith1910）Daviselal.1984简称

Cmw）0

异名：Corynebcicteriummichi^anensepV.michi^ariense（Smith）Dye&Kemp；Cory/iebacterium

（Smilh）Jensen。

病害英文名：Bacterialcankeroftomato„

属细菌域Bacteria、放线菌门Actinobacteria、放线菌纲Actinobacteria、放线菌目Actinomvcetales、

微杆菌科Microbacleriaceae、棒形杆菌属Clavibactero

该病原菌的远距离传播主要靠带菌种子，番茄种子内外层都可带菌。在田间和温室，该病菌由伤

口、气孔和自然孔口侵入寄主组织，主要通过灌溉水、雨水、修枝剪、培养料等传播。该病菌在土壤和病

残体组织中可存活2年〜3年。

番茄溃疡病菌的其他基本信息参见附录Ao

4方法原理

根据番茄溃疡病菌的危害状，対检疫现场或田间病害调查中发现的疑似病害症状样品进行采集并

带回实验室作进一步分离鉴定，依据病原菌的培养性状、致病性反应以及分子生物学特征对种类进行

判定。

5仪器和用具

生物显微镜、超净T作台、高压灭菌锅、光照恒温培养箱、恒温振荡培养箱、电子天平、低温冰箱、接

种环、牙签、注射器、恒温水浴锅、高速冷冻离心机（12000r/min以上）、匀浆机、PCR仪、电泳装置（电

泳仪和水平电泳槽）、凝胶成像分析仪、微量可调加样器等。

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GB/T29431—2012

6主要试剂

蔗糖、蛋白腺、酪蛋白水解物、酵母膏、葡萄糖、磷酸氢二钾（K2HPO4）.磷酸二氢钾（KH2P（）4）.硫

酸镁（MgSO4・7H2O）.琼脂、蔡喘酮酸钠、硫酸多粘菌素、放线菌酮、硼酸（H2BOJ.甘油、磷酸氢二钠

（Na2HPO4）.吐温-20（Tween-20）、硫代硫酸钠（Na2S2O3）.氯化鞍（NH4C1）.Trizma碱、烟酸、亚确酸

钾、甘露糖、碳酸钙（CaCOQ、乙二胺四乙酸（EDTA）、三疑甲基氨基甲烷（Tris）、十二烷基磺酸钠

（SDS）、液氮、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、琼脂糖（电泳用）、TaqDNA聚合酶、DNAMarker。

7检测鉴定方法

7.1现场检疫和抽样

番茄种植田间的病害调查或进岀境番茄样品的现场检疫中，若番茄植株或果实病害症状表现与附

录A中描述类似，取样带回实验室作进一步分离鉴定；对番茄种子可进行种植观察或样品分离鉴定。

取样方法和步骤按SN/T2122。

7.2种植观察

将待测的番茄种子种植于温室或实验室的育苗钵（钵内土壤或基质应灭菌）中，每份种子样品种植

5000粒左右，最少不低于3000粒种子，生长环境温度24°C〜34°C,相对湿度大于或等于70%,种子

出苗后15d内观察幼苗发病情况。如果种植期间有发病幼苗，且表现出番茄溃疡病苗期的典型症状

（参见附录A），则进一步采集可疑病株进行分离鉴定。

7.3分离培养

7.3.1种子中病原细菌的分离培养

7.3.1.1种子细菌浸提液制备

将24g种子（至少12g）样品加入灭菌袋，加种子提取缓冲液（按1g种子加4mL提取缓冲液比

例），4匸培养过夜（最少14h）在匀浆机上至少浸7min。分离培养番茄溃疡病菌所用的缓冲液、培养

基配方见附录B。

7.3.1.2半选择性培养基平板分离

用三层消毒纱布（或过滤袋）过滤种子浸提液，至少取2niL过滤提取液,8000g离心15min仔细

除去上清液，沉淀用十分之一离心体积的无菌种子提取液悬浮，并用无菌种子提取液进行10倍梯度稀

释（稀释到100倍），取0.1mL每一稀释度分别涂布于D2ANX和SCM或mSCM半选择性培养基平

板。同时，用无菌种子提取缓冲液制备Cmm标准菌株10倍系列稀释液，取0.1mLCmm标准菌株的

每一个稀释浓度分别涂布于上述半选择性培养基平板上，以保证至少一个平板菌落数在50-200个范

围内。将培养皿于26°C〜28°C培养，在5d、7d、10d各检查平板菌落生长情况。检查Cmm标准菌株

在两种培养基上生长情况和菌落形态特征。检查待测样品培养皿中是否有Cmm可疑菌落，与Cmm标

准菌株比较。记录可疑菌落和其他菌落数。

在D2ANX±培养5d〜7d后,Cmm菌落黄色，黏液状，凸起。

在SCM±培养10d后，Cm”菌落灰白半透明，黏液状，最后为不规则型，中间内部有黑点（斑）。

在mSCM上培养10d后,Cmm菌落半透明米白，黏液状，最后为不规则型，中间内部带有黄色/橙

色点（斑）。

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GB/T29431—2012

菌落的大小和颜色在不同样品中可能存在差异。通常Cmm的形态和颜色在SCM和mSCM会发

生变化。如果存在菌落形态和颜色的变化，每批样品每个皿至少挑取5个可疑菌落在YDC培养基上做

进一步纯化培养观察。在YDC上菌落黄色，圆形，凸起，黏液状，挑取具有这些特征的菌落，做

进一步的番茄致病性测定。注意在YDC±划线过程中，若菌落未分开，其菌落形态不一定总是圆形

的，如果存在这种情况，可挑取这些可疑菌落先进行紫茉莉CMirabilisjalapa）接种检测，若测定为阳

性，则进一步在番