DB37/T 1828-2011 猪流行性乙型脑炎RT-PCR检测技术

ICS65.020.30

B40

DB37

山东省地方标准

DB37/T1828—2011

猪流行性乙型脑炎RT-PCR检测技术

RT-PCRAssayfortheDetectionofSwineEpidemicEncephalitisB

2011-04-08发布2011-06-01实施

山东省质量技术监督局发布

DB37/TXXXX—XXXX

前言

本标准的编制依据GB/T1.1-2009的规定。

本标准由山东省农业科学院提出。

本标准由山东省畜牧业专业标准化技术委员会归口。

本标准起草单位：山东省农业科学院畜牧兽医研究所。

本标准主要起草人：王金宝丛晓燕吴家强李俊杜以军时建立孙文博。

I

DB37/TXXXX—XXXX

猪流行性乙型脑炎RT-PCR检测技术

1范围

本标准规定了猪流行性乙型脑炎RT-PCR检测技术的操作要求。

本标准适用于猪流行性乙型脑炎病毒核酸的检测。

2实验室生物安全要求

实验室必须为生物安全Ⅱ级（BSL-2级）以上实验室。

3试剂

3.1变性液：见附录A.1。

3.22M醋酸钠溶液(pH4.0)：见附录A.2。

3.3水饱和酚（pH4.0）

3.4氯仿/异戊醇混合液：见附录A.3。

3.5AMV反转录酶（200U/μL）。

3.6RNA酶抑制剂(40U/μL)。

3.7TaqDNA聚合酶(5U/μL)。

3.81.0%琼脂糖凝胶：见附录A.4。

3.950×TAE缓冲液：见附录A.5。

3.10溴化乙锭(10μg/μL)：见附录A.6。

3.11加样缓冲液：见附录A.7。

3.12焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的灭菌双蒸水：见附录A.8。

3.135×反转录反应缓冲液：见附录A.9。

3.142.5mmol/LdNTPs：见附录A.10。

3.1510×PCRBuffer：见附录A.11。

3.16DNA分子量标准2000bp。

3.17Eagle’s液。

3.18引物：

1

DB37/TXXXX—XXXX

上游引物P1：5＇-ATCCTGGCTATGCTTTCCT-3＇；

下游引物P2:5＇-CTCTGTTTCTCCACGCTGT-3＇；

扩增片断长度819bp。

4操作程序

4.1样品的采集和处理：

4.1.1样品的采集

流产胎儿脑组织、发病公猪精液或蚊子，置于-20℃或液氮中保存。

4.1.2样品的处理

4.1.2.1组织样品处理：取待检脑组织病料0.5g或公猪精液200μL，加入400μL变性液混匀研磨。取

已研磨好的待检组织样品上清200μL,置1.5mL灭菌离心管中，加入200μL变性液，混匀。

4.1.2.2蚊子样品处理：从-20℃冰箱或液氮罐中取出蚊子样品，倒入研磨器，加入1mLHank’S液清

洗，吸出液体在研磨器中加入1mLEagle’s液，将蚊虫样品研磨成匀浆。将研磨液约1mL吸入离心管，

4℃12000rpm离心20min。上清液用0.22μm规格的滤器过滤，备用。

4.1.2.3阳性对照处理：取乙脑病毒弱毒疫苗200μL,置1.5mL灭菌离心管中，加入200μL变性液，

混匀。

4.1.2.4阴性对照处理：取健康猪脑组织或精液200μL，置1.5mL灭菌离心管中，加入200μL变性液，

混匀。

4.2RNA的提取

4.2.1设立阳性、阴性样品对照。

4.2.2异硫氰酸胍一步法

4.2.2.1向组织或细胞中加入200μL变性液，匀浆。

4.2.2.2将匀浆混合物移至新的1.5mL离心管中，向每毫升变性液中立即加入100μL乙酸钠、1mL酚、

200μL氯仿-异戊醇。加入每种试剂后，盖上试管盖，倒置混匀。

4.2.2.3将匀浆混合物剧烈振荡10s，冰浴15min。

4.2.2.4上述匀浆混合物12000rpm，4℃离心20min，将上层水相移入新的1.5mL离心管。

4.2.2.5加入等体积的异丙醇，充分混匀，于-20℃沉淀RNA至少1h。

4.2.2.64℃12000rpm离心10min，弃上清，用75%的乙醇洗涤沉淀，离心，彻底弃去上清，自然条

件下干燥沉淀，溶于50μLDEPC处理的水中,-20℃贮存，备用。

4.2.3也可选择市售商品化RNA提取