GB/T 36752-2018 藜草花叶病毒检疫鉴定方法

ICS65.020.01

B16

国

中华人民共和国国家标准

GB/T36752-2018

黎草花叶病毒检疫鉴定方法

DetectionandidentificationofSowbαnemosαicvirus

2018-09-17发布2019-04-01实施

国家市场监督管理总局啦告

中国国家标准化管理委员会保叩

GB/T36752-2018

目lj昌

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。

本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口。

本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中华人民共

和国厦门出入境检验检疫局、浙江大学。

本标准主要起草人：张永江、冯黎霞、向均、廖富荣、吴建祥、辛言言、李桂芬、陈青。

I

GB/T36752-2018

附录D

（规范性附录）

实时荧光RT-PCR检测

D.1试剂

核酸提取试剂同C.1.1。

Tc1qMan一步法反转录聚合酶链式反应混合物。

D.2号｜物探针

上游引物SoMVF,5'-CAAACGATAGTCTCCACCACTGACAAAT-3'

下游引物SoMVR,5＇”TGTCAATGTTCCCTTGTACAGATGTGG-3'

探辛十SoMVP:5'-FAM-CTGGTTGAGTGGCGTGGCCGTTA-TAMRA-3'。

D.3核酸提取

方法同C.2.1。

D.4实时荧光RT-PCR反应

反应体系：0.2mL离心管中力ll人2×一步法反转录聚合酶链式反应？昆合物10µL，酶混合物

0.6vL,SoMVFOOµmol/L)0.4µL,SoMVR(lOµmol/L)0.4µL,SoMVP(lOµmol/L)0.8µL，模板

RNA2/.LL，补DEPC-H20至20µL。设置阳性对照、阴性对照及空白对照。

反应程序：45°C10min;95°C10mi口；95℃15s,60℃1min，共45个循环。

D.5结果判定

在空白对照及阴性对照元Ct值且无扩增曲线、阳性对照Ct值《30并出现典型扩增曲线的条

件下：

待测样品的Ct值二三40时，判定SoMV阴性。

待测样品的Ct值ζ35时，判定SoMV阳性。

待测样品的Ct值小于40且大于35时，应重新进行测试；如果重新测试的Ct值注40，判定SoMV

阴性；如果重新测试的Ct值小于40且大于35，且分离曲线明显时，则判定结果为阳性。

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GB/T36752-2018

附录E

（规范性附录）

斑点酶联免疫眼附测定（Dot-ELISA)

E.1试剂材料

E.1.1硝酸纤维素膜

孔径为0.45µm的硝酸纤维素膜。

E.1.2第一抗体

特异性的黎草花叶病毒抗体。

E.1.3酶标第二抗体

碱性磷酸醋酶标记的羊抗鼠种特异性抗体，是抗某种动物的酶标抗体，能和第一抗体相结合。

E.1.4底物储备液

四氮I哇兰（NBT）和5-f臭，4”氯，3日SI睐，磷酸盐(BCIP）底物储备液：NBT‘溶于70%二甲基甲酷胶中，

NBT储备液配成50mg/mL浓度，BCIP溶于100%二甲基甲酷脑中，BCIP储备液配成50mg/mL浓

度，2种底物储备液分别装于瓶中一20℃保存。

E.1.5PBS缓冲液

氯化纳（NaCl)8.0g

磷酸氢二纳（Na2HP0,1•12H20)3.0g

磷酸二氢押（KH2P04)0.2g

氯化钥1(KC[)0.2g

调pH至7.4，蒸锢水定容至1000mL。

E.1.6PBST缓冲液（洗涤缓冲液）

PBS缓冲液1000mL

吐温－20(Twcen-20)0.5mL

E.1.7封闭液（抗体稀释液）

脱脂奶粉5.0g

PBST缓冲液100mL

E.1.8底物显色缓冲液

三是甲基氨基甲皖（Tris)12.14g

氯化铀（NaCl)5.84g

氯化镜（MgCl2)0.475g

用盐酸调pH至9.5，蒸幅水定容至1000mL。

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GB/T36752-2018

E.1.9底物显色液

10mL的底物缓冲液中力II入66µLNBT储备液和33µLBCIP储备液。

E.2操作步骤

E.2.1样品制备

待测样品按1:20（即1g样品加入20mL缓冲掖）力[I入PBS缓冲液，用研钵刷磨成浆，5000!-f离

心3min，上清即为制备好的检测样品。阴性对照、阳性对照作相应的处理。

E.2.2点样

用银子取一张膜放至干净的培养皿内，用移液枪取3µL病叶提取液上清轻点到膜上，每取一个样

换一个枪头。

E.2.3膜干燥

点样完成后膜在室温下干燥，直至看不到点样水印为止，约10min。

E.2.4量才闭

膜在封闭缓冲液中37·c振荡孵育30min。

E.2.5加第一抗体

在一个平皿中用抗体稀释液将黎丰花叶病毒特异性鼠源单克隆抗体稀释成1:2000倍溶液（体积

比），用银子将膜放入抗体溶液中，室温水平摇床上缓慢摇动ffpf育60min；倒去上述抗体溶液后加入

PBST洗涤液，在水平摇床上缓慢摇动洗涤膜3min；重复洗涤2次。

E.2.6加酶标第二抗体

用抗体稀释液将碱性磷酸醋酶（AP）标记的羊抗鼠酶标二抗稀释成1:8000倍潜液（体积比），用

慑子将膜放入上述酶标二抗语液中，室温水平摇床上缓慢摇动孵育60min；倒去上述酶标二抗溶液后

力｜｜入PBST洗涤液，在水平摇床上缓慢摇动洗涤:>IC膜3min;PBST重复洗涤3次；最后再洗涤1次以

去除膜表面的吐温－20。

E.2.7加底物显色

在一个干净的平皿中加入10mL底物缓冲液、66µLNBT和33µLBCIP底物储备液，泪匀；将洗

好的NC膜放入平皿中避光显色10min~20min，将膜用自来水漂洗一下洗去底物终止反应。

E.3结果判断

E.3.1当阳性对照出现紫色斑点，阴性对照未出现紫色斑点时，若样品出现紫色斑点，则检测结果为阳性。

E.3.2当阳性对照出现紫色