GB/T 36778-2018 燕麦花叶病毒检疫鉴定方法

ICS65.020.01

B16

国

中华人民共和国国家标准

GB/T36778-2018

燕麦花叶病毒检疫鉴定方法

DetectionandidentificationofOatmosaicvirus

2018-09-17发布2019-04-01实施

国家市场监督管理总局啦告

中国国家标准化管理委员会保叩

GB/T36778-2018

目lj昌

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。

本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口。

本标准起草单位：中华人民共和国宁波出入境检验检疫局、浙江省农业科学院、中华人民共和国北

京出入境检验检疫局、中华人民共和国内蒙古出入境检验检疫局。

本标准主要起草人：郭立新、段维军、梁新苗、杨永生、孙丽英、吴薇、荣德福。

I

GB/T36778-2018

附录C

（规范性附录）

一步RT-PCR检测方法

C.1主要试剂

巳1.150×TAE缓冲液

三控甲基氨基甲炕（Tris）碱242g

57.1mL

冰乙酸

乙二胶四乙酸（EDTA)(0.5mol/L,pH8.0)100mL

双蒸水定容到1L。

C.1.26×Loading缓冲液

0.25%（质量：体积）

？臭酣蓝

0.25%（质量：体积）

二甲苯青FF

40%（质量：体积）

I点糖水洛液

贮存于4°C。

C.2引物序列

正向引物OMVCPF,5'-GACAATGGAACAGGATCAATG-3＇；反向引物oligo-d(T)Notl

prim巳r:5'-CAATTCGCGGCCGC(T)i5-3＇；扩增区域在外壳蛋白基因和Poly(A）上，扩增片段大小

为758bp0

C.3试验步骤

C.3.1植物总RNA的提取

C.3.1.1取0.1g样品，加液氮研磨成粉末状，将研磨物迅速移入1.5mL离心管中，加入1mLTrizol

Reagent，颠倒棍匀，2℃～8℃，12000K，离心10min。

C.3.1.2取上洁，15℃～30℃，放置5min；加入0.2mL三氯甲烧，用于剧烈震荡（勿涡旋振荡），约

15so15℃～30℃，放置2min~3min;Z°C～8℃，12000g，离心15min。

C.3.1.3小心吸取约为600/.tL的上层水相，勿扰动中间相和下层相。如1500µL异丙醇混合上清液，

15℃～30℃，放置10mino2℃～8℃，12000g，离心10mino

C.3.1’4去除上洁液，沉淀中加入1mL75%乙醇，洗涤；2℃～8℃，7500g，离心5mm

C.3.1.5去除上清液，沉淀自然干燥后，将其溶于30µL~50µL元RNas巳的双蒸水中。

注：梳物总RNA的提取也可使用相应市售RNA提取试剂盒提取。土壤巾RNA的提取可使用相应市售RNA提

取试剂盒提取。

C.3.2RT-PCR

在25µL反应体系中加｜入2.5µL10×RT-PCR缓冲液，5µLMgCl2(25mmol/L),2.5µLdNTP

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GB/T36778-2018

Mixture（各10mmol/L),0.5µLRNaseInhibitor(40U/µL),0.5µLAMYRTascXL(5U/µL),

0.511LAMV-0ρtimi:::PdT(l(1(5U/µL),0.511L引物OMVCPF(20,umol/L),0.511L引物。ligo-d(T)

Notlprimer(20µmol/L),1µLRNA,RNaseFreeddH20补至25µL反应条件为：50℃30min,

94℃2min；然后94。C30s,58℃30吕，72℃60s，共乌35个循环；72℃5min

注：反应体系中各试剂的量；可根据具体情况或不同的反应总｛木积进行适当调整。也可采用其他商业RTPCR试

剂盒。

C.3.3PCR产物的琼脂糖凝胶电泳

灌制1.5%琼脂糖凝胶板，室温凝胶30min，取5µLPCR产物与6×loading缓冲破1昆匀后点样，用

DNAMarker作分子量标记，在1×TAE中以5V/cm的电压电泳30min。？真化乙键洛液

(0.511g/mL)染色10min，用凝胶成像仪照相。

注可用漠化乙饺替代产品染色。

C.4结果判断

阴性对照和空白对照在758bp处未出现扩增条带，待测样品与阳性对照在758bp处出现扩增条

带，判定结果为阳性。

阴性对照和空白对照在758bp处未出现扩增条带，阳性对照在758bp处出现扩增条带，且样品无

特异性扩增，判定结果为阴性

。

10

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参考文献

[l]陈剑平．应用免疫电镜技术快速检测菜豆黄花叶病毒、马铃薯M病毒和燕麦花叶病毒〔J].

病毒学杂志，1991,6(1):53-58.

[2]郑滔．大麦和性花叶病