DB22/T 2083-2014 食用菌菌种真实性鉴定 RAMP法

ICS65.020

B61

DB22

吉林省地方标准

DB22/T2083—2014

食用菌菌种真实性鉴定RAMP法

Verificationofgenuinenessforediblemushroomspawn—RAMP

2014-05-04发布2014-06-01实施

吉林省质量技术监督局发布

DB22/T2083—2014

前言

本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2001给出的规则起草。

本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。

本标准由吉林省农业委员会提出并归口。

本标准起草单位：吉林农业大学。

本标准主要起草人：宋慧、刘晓龙、金周雨、汤海峰、宗立立、李雨婷、王健、谭旭华、李艳丽。

I

DB22/T2083—2014

食用菌菌种真实性鉴定RAMP法

1范围

本标准规定了利用RAMP技术鉴定食用菌菌种真实性的分析步骤、结果记录、分析鉴定的方法。

本标准适用于猴头菌（Hericiumerinaceus）、小刺猴头菌（Hericiumcaput-medusae）、珊瑚状

猴头菌（HericiumcoralloidesPers）、黑木耳（Auriculariaauricular）和光帽鳞伞（Pholiotanameko）

食用菌菌种真实性的鉴定。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T12728食用菌术语

3术语和定义

GB/T12728界定的以及下列术语和定义适用于本文件。

3.1

随机扩增微卫星DNA多态性标记RandomAmplifiedMicrosatellitePolymorphism（RAMP）

是以1条与微卫星序列互补的SSR引物和1条RAPD随机引物相组合，对基因组中的微卫星序列与

随机引物互补序列之间的DNA片段进行随机扩增的技术。

3.2

菌种真实性VerificationofSpawn

供检菌种与对照菌种的符合性

4RAMP标记原理

采用RAMP标记扩增基因组中微卫星序列与随机引物互补序列之间的DNA片段，通过比较试样与对照

指纹图谱，从而对菌种进行鉴定。

5仪器设备及试剂

见附录A。

6溶液配制

1

DB22/T2083—2014

见附录B。

7分析步骤

7.1菌丝培养

7.1.1培养基的制备

称取去皮马铃薯200.0g，制备成均匀碎块（约1cm3），加蒸馏水1000mL，煮沸30min，滤除固体

残渣，在马铃薯汁液中加入葡萄糖20.0g，硫酸镁0.5g，磷酸二氢钾0.46g，磷酸氢二钾1.0g，琼

脂18.0g，加热使其充分溶解，定容至1000mL，pH自然，装入试管，塞好试管塞。121℃-126℃，高压

灭菌30min，摆成斜面冷却后使用。

7.1.2接种

将供检菌株与对照菌株在相同条件下培养，培养量可供做3个平行鉴定试验。将待供检菌株与对照

菌株在无菌条件下，切取（3～5）mm×（3～5）mm大小一块母种，迅速转移至试管斜面培养基中央位

置，每个菌株接种20支～30支试管。

7.1.3恒温培养

将接种后的试管置恒温培养箱中，分别在25℃条件下避光培养黑木耳9d～12d，猴头菌、小刺猴

头菌、珊瑚状猴头菌培养12d～15d；在20℃条件下避光培养光帽鳞伞15d～20d。

7.2DNA提取

7.2.1称取0.1g的菌丝置于无菌研钵中，在液氮中充分研磨成粉末；

7.2.2将菌丝粉末迅速转移至1.5mL离心管中，加入600µL的65℃预热的CTABDNA提取缓冲液，

置于65℃水浴45～60min，每5min～15min颠倒混匀；

7.2.3加入等体积苯酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)抽提10min，颠倒混匀，4℃，12000rpm离心5min；

7.2.4取上清加等体积氯仿-异戊醇（24:1）抽提10min，颠倒混匀，4℃，12000rpm离心5min，

重复7.2.4抽提1次；

7.2.5加等体积异丙醇-20℃充分沉淀；

7.2.64℃，5000rpm离心10min，弃上清；

7.2.7加500µL的70%乙醇洗涤沉淀2次，室温干燥，加40µL的TE缓冲液（pH8.0）溶解；

7.2.8加入10mg/mL的RNase溶液至终浓度达50μg/mL，去除RNA，37℃水浴1h；

7.2.9重复操作7.2.3～7.2.5，加入100μLTE缓冲液（pH8.0），使DNA充分溶解，并置于4℃冰

箱中保存备用

注：长期保存应采用-20℃；多次测定需分装保存，每次使用后不再重新冻存。

7.3DNA纯度检测

7.3.1电泳检测

取1%琼脂糖溶液40mL加入4µL的溴化乙锭，缓慢倒入凝胶托盘中冷却，避免出现气泡，插入

梳子，待胶体凝固后，缓慢拔出梳子，将凝胶托盘置于装有1×TAE缓冲液的水平电泳槽中；在凝胶点

样孔中加入5µL菌株DNA提取液与2µL的6×Loadingbuffer的混合液体，用5µL的λHindⅢMarker

作为参照；采用100V恒压电泳，待溴酚蓝前沿指示剂移动到距凝胶前沿0.5cm～1cm处，停止电泳

2

DB22/T2083—2014

（约1h）；在凝胶成像系统中观察并照相；电泳条带应呈现单一清晰状态，否则重新提取DNA。

7.3.2紫外检测

取3µLDNA提取液，用无菌水稀释至一定倍数，混匀后，加入石英比色皿中，加入量为比色皿体

积的3/4，并以无菌水或TE缓冲液为空白对照，用紫外-可见分光光度计分别在260nm和280nm下测量其

OD值，计算OD260/OD280比值，如果该比值在1.6~1.8之间，可以进行PCR反应，否则重新提取DNA。

待测样品含量（µg/mL）=OD260值×稀释倍数×50

7.4PCR扩增

7.4.1RAMP引物及其使用

由4条SSR引物和10条RAPD引物组成40对核心引物。使用时首先选用5对参见附