DB12/T 653-2016 鲜冻畜、禽肉中动物源性成分的定量检测 实时荧光PCR法

ICS67.050

B45

DB12

天津市地方标准

DB12/T653—2016

鲜冻畜、禽肉中动物源性成分的定量检测

实时荧光PCR法

QuantitativePCRmethodforanimalderivedmaterialsinmeatandmeatproducts

2016-09-27发布2016-11-01实施

天津市市场和质量监督管理委员会发布

DB12/T653—2016

前言

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。

本标准由天津市农村工作委员会提出。

本标准起草单位：天津市农业质量标准与检测技术研究所、天津市东丽区产品质量监督检验所。

本标准主要起草人：赵新、易萌、刘娜、兰青阔、刘雪岩、陈锐、朱珠、王成、徐石勇。

本标准2016年9月首次发布。

I

DB12/T653—2016

鲜冻畜、禽肉中动物源性成分的定量检测

实时荧光PCR法

1范围

本标准规定了鲜冻畜、禽肉中动物源性成分（包括牛、羊、猪、鸡、鸭等）的定量PCR检测方法

的术语和定义、检测方法、结果计算。

本标准适用于生鲜、冷冻畜禽肉中动物源性成分的定量PCR检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

实时荧光PCRrealtimePCR

实时荧光PCR是指PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时检测整个PCR过程，

对未知模板进行定性或定量分析。

3.2

Ct值cycletime

每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。

3.3

内参基因referencegene

能够同时检测出多种动物源性成分的基因（包括牛、羊、猪、鸡、鸭等）。

3.4

牛源性成分bovine-derivedmaterials

牛种属特异性DNA片段。

3.5

羊源性成分ovine-derivedmaterials

羊种属特异性DNA片段。

3.6

猪源性成分porcine-derivedmaterials

猪种属特异性DNA片段。

3.7

鸡源性成分chicken-derivedmaterials

鸡种属特异性DNA片段。

3.8

鸭源性成分duck-derivedmaterials

鸭种属特异性DNA片段。

1

DB12/T653—2016

4原理

根据牛、羊、猪、鸡、鸭等的DNA特征序列，筛选种间保守区域设计一对通用引物和种内特异

性区域设计五对种属特异性引物，通用引物可同时扩增牛、羊、猪、鸡、鸭等多种动物源性DNA，采

用TaqMan实时荧光PCR技术，根据标准参照物模板含量与Ct值间的线性关系，绘制标准曲线，计

算试样中种属特异性基因和内参基因的比值，从而对鲜冻畜、禽肉中动物源性成分进行定量检测。

5检测方法

5.1试剂和材料

除非另有说明，仅使用分析纯试剂和重蒸馏水或符合GB/T6682规定的一级水。

5.1.1DNA提取用试剂

三氯甲烷；异戊醇；乙酸钠；无水乙醇；Tris饱和酚；裂解液：10mmoL/LTris-HCl（pH8.0），

25mmol/LEDTA（pH8.0），5g/LSDS，0.1g/L蛋白酶K；TE缓冲液（Tris-HCl、EDTA缓冲液）：10mmoL/L

Tris-HCl（pH8.0），1mmol/LEDTA（pH8.0）。

5.1.2TaqMan荧光PCR反应试剂盒

5.1.3引物和探针。

表1动物源性成分内参基因和种属特异性基因引物和探针序列

检测基因引物序列扩增片段长度基因性质

16S-F：5′-ACCGTGCAAAGGTAGCATAATCA-3′

16SrDNA16S-R：5′-GCTCCATAGGGTCTTCTCGTCTT-3′82bp内参基因

16S-P：5′-FAM-ACTTGTATGAATGGCCGCACGAGGGTT-TAMRA-3′

Rd1-F：5′-GTAGGTGCACAGTACGTTCTGAAG-3′

Rd1Rd1-R：5′-GGCCAGACTGGGCACATG-3′95bp牛源基因

Rd1-P：5′-FAM-CGGCACACTCGGCTGTGTTCCTTGC-BHQ1-3′

OA-F：5′-CCAACATGCCTTTAAACCCTCAA-3′

OA-PRLPOA-R：5′-GGAACTGTAGCCTTCTGACTCG-3′88bp羊源基因

OA-P：5′-FAM-GAGACTGGCGGGGAAGGAAAGGCA-TAMRA-3′

Sus-F：5′-GGAGTGTGTATCCCGTAGGTG-3′

Sus-ACTBSus-R：5′-CTGGGGACATGCAGAGAGTG-3′103bp猪源基因

Sus-P：5′-FAM-TCTGACGT