GB/T 36846-2018 马铃薯M病毒检疫鉴定方法

ICS65.020.01

B16

国

中华人民共和国国家标准

GB/T36846-2018

马铃薯M病毒检疫鉴定方法

DetectionandidentificationofPotatovirusM

2018-09-17发布2019-04-01实施

国家市场监督管理总局峪非

中国国家标准化管理委员会0(..'I(J

GB/T36846-2018

目u昌

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。

本标准向全同植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提归井归IIo

本标准起草单位：中华人民共和同黑龙江归入境检验检疫局、中华人民共和同中山出入境检盼检疫

局、中同检验检疫科学研究院、中华人民共和同山东阳入境检验检疫局、浙江大学。

本标准主要起草人：文lj忠梅、刘洪义、马微、陈定虎、来凤侠、张永江、封立平、李明福、吴建祥、李桂芬、

魏梅生、杨立群。

I

GB/T36846-2018

表C.1RT-PCR检测的引物序列

号｜物名称可｜物序列j

PVMRTF5’－CGCATATATGTGAAC心TGG/\-3’

PVM-RT-F5’TCTTTGTGCGTATTGTGAGC-3’

扩增片断长度为416bp。

C.2.3反转录合成cDNA

反转录体系见表C.Zo

表C.2反转录体系

试剂名称

力II样体积／11-L

RN八2

2011-mol/LPVM-RTRl

在70℃泪育5min，然后立即置于冰上；放置5min

5×反转录反应缓冲Uk4

10mmol/LdNTPsl

40U/µLRNA酶捎Jilli剂0.5

200U/11-LMMLV反转录酶l

DEPCH20补足至20

反应参数：42°C,45min;95℃，10mino合成的cDNA置于一20℃保存备用。

C.2.4PCR扩增

PCR反应以cDNA为模板进行扩增，每个样品设2个平行处理。以健康植物材料为阴性对照，以

ddH20为空白对照。PCR反应体系见表C.3。也可采用RT-PCR一步法试剂盒，操作步骤按使用说明

进行。

表C.3PCR反应体系

试剂名称

力II样体积／µL

10×PCR反应缓冲浪2.5

25mrnol/LMgCl2C反应缓冲浪巾已含有的可不如l入〉2.5

10mmol/LdNTPsl

20µrnol/LPVM-RT-Fl

20,umol/LPVM-RT-Rl

5U/11-LTuqDNA聚合酶0.2

cDNA模极2

ddH20补足至25

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GB/T36846-2018

PCR反应条件：94℃3min;94℃30s、57℃305、72℃40s,35个循环；72℃10min。

C.2.5琼脂糖凝胶电泳检测

将制胶板同制好的琼脂糖凝胶一井放入水平电掠槽，取5µL扩增反应物加1µL的6×澳盼蓝上

样缓冲液混匀，以及5,uLDNAMarker作为分子量标准物分别点入样孔内。电泳缓冲液1×TAE适

量，100V，电泳30mino电泳结束后，放入0.5µg/mL澳化乙链（或其替代物）洛液中染色10min，将整

个凝胶置于凝胶成像系统上拍照，记录结果。

C.2.6PCR产物测序

电掠后，将在416bp左右处有特异条带的PCR产物进行序列测定。

C.3结果判定

C.3.1阳性对照在416bp左右’处有条带，阴性对照、空白对照和待测样品在该处元特异性条带，则可

判定待测样品为PVM阴性。

C.3.2阳性对照在416bp左右处有条带，阴性对照和空白对照在该处无特异性条带，待拍JI］样品出现和

阳性样品一致的条带，测定序列结果经比对为PVM的，序列相似性＞95%，可判定待测样品为PVM

阳性。

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GB/T36846-2018

附录D

（规范性附录）

RT-LAMP检测

D.1试剂

D.1.1一步法RT-LAMP反应试剂盒。

D.1.2LAMP荧光目视检测试剂盒。

D.2实验步骤

D.2.1总RNA提取

总RNA提取见C.2.1。

D.2.2引物合成

引物序列见表D.l。

表D.1RT-LAMP引物序列

可｜物名称序列（5’－3’〉

PVMF35’-TTCJ\GGCCGTGCTGTTCT-3'

PVMB35’-CAGCJ\TGTGGTTCC八AGTCJ\-31

PVMFIP5’-GC八CCCCTAGGCCACTCAJ\八－GGATGCA八GCAGCTCAGT-3’

PVMBIP5’-GGACGCTGTGCTTGCTGTGA-CJ\GGCGCAT八CAACCT八CA-3’

D.2.3RT-LAMP反应

D.2.3.1RT-LAMP反应体系

RT-LAMP反应体系以RNA为模棍，以健康植物材料为阴性对照，以ddH20为空向对照，以感染

PVM的植物材料为阳性对照。RT-LAMP反应体系见表D.2。整个榕液的配制在冰上进行，也可采用

其他等效LAMP试剂。RT-LAMP反应条件：“℃恒泪扩增60min,80℃5min

表D.2RT-LAMP反应体系

试剂名称