GBZ/T(卫生) 243-2013 单细胞凝胶电泳用于受照人员剂量估算技术规范

ICS13.100

C60

中华人民共和国国家职业卫生标准

/—

GBZT2432013

单细胞凝胶电泳用于受照人员

剂量估算技术规范

ㅤㅤㅤㅤ

Secificationofdoseestimationfortheradiationvictims

p

intheearlstaeusinsinlecellelelectrohoresis

yggggp

2013-03-14发布2013-07-01实施

中华人民共和国卫生部发布

/—

GBZT2432013

单细胞凝胶电泳用于受照人员

剂量估算技术规范

1范围

本标准规定了基于单细胞凝胶电泳方法检测电离辐射导致人外周血淋巴细胞脱氧核糖核酸

()损伤的剂量响应曲线和时间响应曲线的建立方法。

DNA--

()()(

本标准适用于检测低传能线密度射线或射线一次性急性外照射导致的早期以

LETXγ72h

内)DNA损伤。

、

本标准不适用于高LET和慢性职业受照人群非均匀照射和内照射受照人群的生物剂量及事故性

受照者远期随访。

2术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

2.1

单细胞凝胶电泳sinlecellelelectrohoresis

ggp

彗星分析cometassaㅤㅤㅤㅤ

y

在单细胞分子水平上定量分析各种因素导致的细胞DNA残留损伤水平的一种方法。

2.2

尾矩;

OliveolivetailmomentOTM

、。

尾部DNA百分含量与头尾部重心间距离的乘积

2.3

剂量响应曲线

-dose-resonsecurve

p

,,

当机体受照后引起的反应与受照剂量存在某种定量关系可用适当的数学模式表达可绘制出相应

,。

的刻度曲线用其估算受照剂量

2.4

时间响应曲线

-time-resonsecurve

p

,,

机体受照后DNA损伤修复很快启动残余的DNA损伤与受照剂量之间存在某种时相定量关系

,,,

用适当的数学模式表达以绘制出相应的刻度曲线估算受照剂量时与剂量响应曲线结合应用以减少

-

DNA损伤修复对估算结果的影响。

3单细胞凝胶电泳方法

3.1淋巴细胞分离

预先在离心管中加入预冷的淋巴细胞分离液,外周血沿离心管内壁

0.5mL0.2mL4℃0.1mL

,/,

轻轻加在淋巴细胞分离液面上3500rmin离心2min将分离出的灰白色淋巴细胞层转移至2mL离

,,/,。,

心管中加至轻摇混匀后离心弃上清重复洗涤细胞次将细胞悬于

PBS2mL1500rmin6min2

4/,,。

并调整细胞浓度至置冰箱备用

PBS2×10mL4℃

1

/—

GBZT2432013

3.2铺胶

,(),

0.75%正常熔点琼脂糖凝胶直接煮沸凝固前取100L迅速10s之内均匀铺于彗星玻片上置

μ

,

于冰箱使凝胶固化取制好的淋巴细胞悬液与低熔点琼脂糖凝胶混匀

4℃1min25L75L0.75%

μμ

,。

后均匀铺于第一层凝胶上面置于4℃冰箱固化1min

3.3裂解和电泳

将凝胶置于新鲜配制的中性裂解液中,冰箱中裂解。裂解后用双蒸水漂洗去掉多余的盐

4℃1.5h

,(),

分置于提前加入4℃0.5%TrisboracicEDTATBE电泳液的水平电泳仪中静置20min然后在

--

,电泳条件下电泳。

20V200mA20min

3.4染色和观察

/(),,,,

2mL溴化乙锭EB染色双蒸水漂洗去掉多余染液在荧光显微镜下采集彗星图像每份样

μg

,,。

品采集的细胞数可根据附录提供的公式计算但每份至少采集个彗星图像实验至少重复次

A503

3.5彗星细胞的选择和彗星细胞率()

p

、,,;

选择头尾荧光清晰无重叠无杂质干扰的彗星细胞彗星细胞率为彗星细胞数除以观察细胞总

,。

数以百分数计算

3.6DNA损伤的定量分析

采用彗星分析软件定量分析DNA损伤程度,尾矩定量表示损伤水平。

OliveDNA

ㅤㅤㅤㅤ

剂量响应曲线的建立

4-

4.1对供血者要求

,,,,,

男女各选一人年龄岁岁无肿瘤病史无慢性病史无有毒有害物质接触史未接受过大

18~60

、,,。

剂量的放射诊断治疗史不吸烟不酗酒

4.2细胞样品照射条件

,,,

包埋于凝胶中的淋巴细胞样品均匀照射剂量范围剂量点至少个且分布均

0.1G~5.0G7

yy

,,,。

匀低于剂量点应选个个冰上照射照后立即进行细胞裂解

0.5Gy2~3

4.3单细胞凝胶电泳

按照第章的操作规程进行。

3

剂量响应曲线方程的拟合

4.4-

,,,():

进行曲线拟合若呈直线趋势即用直线模式见式1

…………()

YcαD1

=+

式中:

Y———Olive尾矩值;

c———自发DNA损伤;

α———一次击中导致的DNA损伤;

———,()。

D照射剂量单位为戈Gy

2

/—

GBZT2432013

,,():

若呈抛物线趋势即用二次多项式模式见式2

2…………()

YcαDD2

=++β

式中:

Y———Olive尾矩值;

c———自发DNA损伤;

α———一次击中导致的DNA损伤;

β———二次击中导致的DNA损伤;

———,()。

D照射剂量单位为戈Gy

22

,,

根据回归方程的拟合优度和值的大小选择数学模型值视为模型有统计学意义

Rpp<0.05R

越接近说明该模型的拟合优度越高。

1

时间响应曲线的建立

5-

5.1对供血者要求

同4.1。

5.2血样照射条件

,,,

0.5mL抗凝人外周血样品均匀照射剂量2.0Gy照射温度控制在37℃±0.5℃照后将细胞置

于相同温度体外培养。

5.3培养方法

ㅤㅤㅤㅤ

,。

观察时间时间点至少个照后的全血在无菌条件下接种入为的含

0.5h~72h7pH6.8~7.2

、(),

有适量抗生素胎牛血清的5mLRoswellParkMemorialInstituteRPMI-1640培养体系置37℃恒

,,。

温箱培养培养至相应时间点取出进行单细胞凝胶电泳

时间响应曲线方程的拟合

5.4-

,,,():

进行曲线拟合若呈直线趋势即用直线模式见式3

…………()

YcαT3

=+

式中:

Y———Olive尾矩值;

c———自发DNA损伤;

α———一次击中导致的DNA损伤;

———,()。

T照后时间单位为小时h

,,():

若呈抛物线趋势即用二次多项式模式见式4

2…………()

YcαTT4

=++β

式中:

Y———Olive尾矩值;

c———自发DNA损伤;

α———一次击中导致的DNA损伤;

β———二次击中导致的DNA损伤;

———,()。

T照后时间单位为小时h

22

,,

根据拟合优度R和值的大小选择数学模型值<0.05视为模型有统计学意义R越接近1

pp

说明该模型的拟合优度越高。

/—3

GBZT24320131

0

—

2

附录

A

()3

资料性附录4

拟合剂量响应曲线时观察细胞数的计算2

-

/

T

Z

B

,,

在预实验中观察一定量的细胞数初步计算照后的彗星细胞率可以根据二项式分布95%置信限G

,,()、()、():

公式求出应计数的细胞数生物学实验一般允许误差采用15%见式A.1式A.2式A.3

彗星细胞率95%置信限为:

p(p)

1-

p±1.96………(A.1)

n

令

p(p)

1-

1.96=×15%………(A.2)

p

n

则

(p)170.74

1-×

n=………(A.3)

p

式中:

p———彗星细胞率;

n———应观察细胞数。

ㅤㅤㅤㅤ