DB45/T 2026-2019 甘蔗DNA指纹图谱采集技术规程

ICS65.020.01

B6161B

DB45

广西壮族自治区地方标准

DBDB2026—201945/T

甘蔗DNA指纹图谱采集技术规程

TechnicalregulationsforthecollectionofsugarcaneDNAfingerprintfingerprintDNAsugarcaneofcollectiontheforregulationsTechnical

2019-12-05发布2019-12-30实施

广西壮族自治区市场监督管理局发布

DB45/T2026DB45/T—2019

前言

本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。1.1—2009给出的规则起草。本标准按照GB/T

本标准由广西壮族自治区糖业办公室提出并宣贯监督。

本标准由广西糖业标准化技术委员会归口。

本标准起草单位：广西壮族自治区农业科学院甘蔗研究所。

本标准起草人：高轶静、周会、杨荣仲、熊发前、段维兴、张保青、杨翠芳、周珊、王泽平、张革

民。

I

DB45/T2026DB45/T—2019

甘蔗DNA指纹图谱采集技术规程

11范围

本标准规定了甘蔗DNA指纹图谱采集的术语和定义、原理、仪器设备、操作程序及数据采集。本标准规定了甘蔗DNA指纹图谱采集的术语和定义、原理、仪器设备、操作程序及数据采集。

本标准适用于广西壮族自治区范围内保育和推广的甘蔗品系、品种、杂交种以及甘蔗种质资源的DNA

指纹图谱的采集。

22术语和定义

下列术语和定义适用于本标准。

2.12.1

简单重复序列simplesequencerepeat（SSR）（SSR）repeatsequencesimple简单重复序列

一类由几个核苷酸（一般为2～5个）为重复单位组成的简单串联重复序列。根据其保守的边界序列

设计引物，可通过PCR、电泳技术分析重复序列的重复次数变异。设计引物，可通过PCR、电泳技术分析重复序列的重复次数变异。

2.22.2

核心引物组合coreprimercombinationcombinationprimercore核心引物组合

指品种DNA指纹鉴定优先选用的一套SSR引物，具有多态性高、重复性好、稳定性高、电泳峰易区分

等综合特性，作为统一用于品种DNA指纹数据采集和品种鉴定的引物，以保证不同实验室数据具有可比

性。

2.32.3

参照品种referencevarietyvarietyreference参照品种

对应于特定位点不同等位变异的一组品种，用于辅助确定待测样品在某个位点上等位变异扩增片段

的大小，校正仪器设备的系统误差，以保证不同实验数据具有可比性。本标准选择广西壮族自治区范围

内的主栽品种之一ROC22和重要亲本桂糖11号作为参照品种。内的主栽品种之一ROC22和重要亲本桂糖11号作为参照品种。

33原理

由于不同甘蔗的基因组DNA存在简单重复序列的重复次数差异，这种差异可采用PCR扩增和电泳检测

获得的DNA指纹对不同品种加以区分。获得的DNA指纹对不同品种加以区分。

44仪器设备和试剂配制

仪器设备和试剂配制方法见附录A。仪器设备和试剂配制方法见附录A。

55操作程序

1

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5.15.1样品准备

每份样品至少采集两批，每批采集的样品均包括参照品种ROC22和桂糖11号；单次采集的样品独立

进行实验，作为一次重复。

5.25.2DNA提取

取嫩叶组织约0.2g，迅速剪碎，放入盛有液氮的研钵进行充分研磨后置于离心管中，加入1mL预热

至65℃的DNA提取液，65℃水浴30min，期间轻缓颠倒混匀2次；12000rpm离心20min，吸取上层清液

至2mL离心管，加入等体积的酚:氯仿:异戊醇混合液（25:24:1），轻缓颠倒混匀2，1000rpm离心10min，

取上清液转入新的2mL离心管，再加入等体积氯仿重复抽提一次，吸取上清液至新的2mL离心管；加入

等体积异丙醇，-20℃静置10min，12000rpm离心10min，弃上清液，70%酒精洗涤2次。常温干燥后加

入100μLTE溶解，-20℃保存。DNA质量经OD260/280检测在1.8～2.0之间方可用于后续试验。

上述DNA提取方法为标准推荐使用，在保证DNA提取质量能够符合PCR扩增需要的前提下其它DNA提取

方法均可采用。

5.35.3PCR扩增

5.3.15.3.1SSR引物

5对基本核心引物名单见附录B，参照品种ROC22和桂糖11号对核心引物的指纹图谱见附录C。每对引

物的上游引物5’端用荧光标记。

5.3.25.3.2反应体系

PCR反应体系为20μL，其中10×BPCRuffer（含20mmol/LMg2+）2μL，dNTP（10mmol/L）0.4μ

L，上、下游引物（10μmol/L）各1μL，模板DNA40ng，Taq酶1U。

5.3.35.3.3反应程序

95℃预变性5min；94℃变性30s，50℃～65℃退火30s（退火温度详见附录B），72℃延伸1min，

共35个循环；72℃延伸5min，4℃保存。

5.45.4PCR产物检测

5.4.15.4.1PCR产物样品准备

将荧光标记的PCR产物用超纯水稀释30倍，从混合液中吸取1μL加入到DNA分析仪专用深孔板孔中。

板中每个孔分别加入1μLGS500分子量内标和10μL去离子甲酰胺。将样品在PCR仪上95℃变性5min，

取出立即置于冰上，冷却10min以上。离心10s后放到DNA分析仪上。

5.4.25.4.2开机准备

打开DNA分析仪，检查仪器工作状态，更换缓冲液，灌胶。将装有样品的深孔板放置于样品架基座

上，打开数据收集软件。

5.4.35.4.3编板

按照仪器操作程序，创建电泳板，输入电泳板名称，选择适合的程序和电泳板类型，输入样品编号

或名称。

2

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5.4.45.4.4运行程序

DNA分析仪自动将毛细管电泳数据、运行参数等存放在仪器中。

66数据采集

6.16.1数据表示

6.1.16.1.1应用GeneMarker对毛细管电泳图谱有效特征数据采集，等相关软件包括对应PCR扩增产物的电

泳峰的位置、电泳峰的高度、电泳峰的面积。

6.1.26.1.2进行毛细管电泳图谱有效特征数据的标准化，分别将每对引物中电泳峰高度最高或者电泳峰面

积最大的电泳峰特征数据标准化为1，该对引物其余电泳峰则通过其电泳峰高度与最高电泳峰的比值或

者电泳峰面积与最大电泳峰的比值来标准化（参见附录C）。

6.1.36.1.3利用对应PCR扩增产物大小的电泳峰的位置及其对应的电泳峰特征数据构建甘蔗DNA指纹图谱。

通过电泳峰的有无（即1、0各个电泳峰特征参数标准化值，可以很清楚地将各品种区分开数据）以及

来。

6.26.2结果记录

利用毛细管电泳图谱的电泳峰位置及其对应的电泳峰特征数据参照附录D。每份样品的重进行汇总

复实验中，参照品种ROC22和桂糖11号的电泳峰的特征参数标准化值与库中数据一致，并且样品的电

泳峰的特征参数标准化值数据重复性好，该样品数据才可列入DNA库。指纹数据

3

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附附录A

（规范性附录）（规范性附录）

仪器设备和试剂配制仪器设备和试剂配制

A.1A.1仪器设备

A.1.1A.1.1PCR扩增仪：规格为96孔×0.2mL反应模块。

A.1.2A.1.2DNA分析仪：能够分辨至少1个核苷酸的差异。

A.1.3A.1.3高速冷冻离心机：最大离心力不小于12500rpm。

A.1.4A.1.4电子天平：精度为0.01g。

A.1.5A.1.5微量可调移液器：规格分别为10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL。

A.1.6A.1.6紫外分光光度计。

A.1.7A.1.7低温冰箱：≤-20℃。

A.1.8A.1.8制冰机。

A.1.9A.1.9水浴锅。

A.2A.2DNA提取溶液的配制(用去离子水和分析纯试剂配制)

A.2.1A.2.10.5EDTA溶液mol/L

称取186.1gNa2EDTA•2H2O，加入800mL水，用固体NaOH调节pH至8.0，定容至1000mL，103.4kPa

（121℃）条件下灭菌20min。

A.2.2A.2.21Tris-HCl溶液mol/L

称取60.55gTris碱，溶于400mL水中，用HCl调节pH至8.0，定容至500mL，103.4kPa（121℃）

条件下灭菌20min。

A.2.3A.2.3DNA提取液

称11.69gNaCl放入烧杯中，加入40mL1mol/L的Tris-HCl（pH8.0）和50mL0.5mol/L的EDTA（pH8.0），

加入250mL水，再加入12gSDS，65℃水浴中加热溶解，冷却后定容至400mL。于4℃保存。

A.2.4A.2.4酚:氯仿:异戊醇混合液

将Tris饱和酚、氯仿和异戊醇按25:24:1的比例（V:V:V）配制混合液。

A.2.5A.2.570%乙醇

用量筒量取7