GB/T 33119-2016 葡萄藤猝倒病菌检疫鉴定方法

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中华人民共和国国彖标准

GB/T33119—2016

葡萄藤猝倒病菌检疫鉴定方法

DetectionandidentificationofEutypalata(Pers.)Tul.etC.Tul

2016-10-13发布2017-05-01实施

GB/T33119—2016

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本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。

本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。

本标准起草单位：中华人民共和国山东出入境检验检疫局、青岛检验检疫技术发展中心、中华人民

共和国宁波出入境检验检疫局、中华人民共和国安徽出入境检验检疫局、中华人民共和国湖北出入境检

验检疫局、中国科学院微生物研究所。

本标准主要起草人:王英超、段维军、厉艳、吴兴海、封立平、魏晓棠、甘琴华、纪瑛、邵秀玲、姚剑、

王振华、郭立新、蔡磊.

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GB/T33119—2016

葡萄藤猝倒病菌检疫鉴定方法

1范围

本标准规定了葡萄藤猝倒病菌的检疫鉴定方法。

本标准适用于葡萄等寄主植物中葡萄藤猝倒病菌的检疫和鉴定。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样

SN/T2589植物病原真菌检测规范

3葡萄藤猝倒病菌基本信息

学名tEutypalata(Pers.)Tul.etC.Tul.

异名：EutypcicirmeniucueHansf.M.V.Carter；fra.rhii(Nitschke)Sacc;Eutypamil­

liaria(Fr.)Sacc.;Eutypalatavar.acerisRappaz?Mycol.Helv；CytosftorinalataHohn；Libertella

blepharisA.L.Sm.

分类地位:采用《真菌词典》第10版分类系统，葡萄藤猝倒病菌｛Eutypa人加)属真菌界(Fungi),子

囊菌门(Ascomycota)，盘菌亚门(Pezizomycotina),粪壳菌纲(Sordariomycetes),炭角菌目

(Xylariales)，蕉抱壳科(Diatrypaceae)，弯抱壳属(EutypaTuL&C.Tul.1863)o

传播途径:植物体在贸易和运输中能够传播该病害。植物体主要指树皮(抱子和菌丝)，地上部分的

茎、嫩枝、主干、枝条(菌丝)，木材(抱子和菌丝)等。

葡萄藤猝倒病菌的其他信息参见附录A。

4方法原理

葡萄藤猝倒病菌的为害症状、分离培养性状、形态特征和特异性PCR检测结果等是该检疫鉴定方

法的主要依据。

5仪器设备和主要试剂

5.1仪器设备

生物显微镜、电子天平(感量0.001g)、离心机(12000g)、普通冰箱、超低温冰箱(一80°C)、涡旋振

荡器、恒温光照培养箱、高压灭菌器、生物安全柜、PCR仪、电泳仪、凝胶分析成像系统、可调微量加样

器、全自动DNA提取仪。

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GB/T33119—2016

5.2主要试剂

除另有规定外，所有试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682中相关规定。

0.5%次氯酸钠（NaCK））、葡萄糖、琼脂、硫酸链霉素、盐酸金霉素、氯硝胺。

6现场检疫

按照SN/T2589,仔细检查寄主植物的茎、枝条、叶片等部位是否出现疑似症状（参见附录A）。茎

部主要看有无溃疡症状；枝条是否长势短小，发育受阻，着生的叶子是否萎黄，卷缩变形或破碎；顶部是

否出现枯萎症状。对可疑植物、繁殖材料应取样送实验室做进一步检验，取样方法和步骤参照

SN/T21220

7实验室检疫

7.1PCR凝胶电泳初筛检测

将第6章中的可疑植物、繁殖材料等样品进行PCR初筛检测，PCR凝胶电泳检测见附录B。对于

阳性结果进行下一步检测。

7.2病原菌的分离和培养

7.2.1马铃薯葡萄糖琼脂培养基和选择性培养基的制备

马铃薯（去皮）200g;葡萄糖20g;琼脂15g;蒸憾水补至1000mL,121£湿热灭菌20min备用。

分离培养时加硫酸链霉素（100卩g/mL）、盐酸金霉素（50卩g/mL）、氯硝胺（5（ug/mL）作为选择性培

养基。

7.2.2病原菌检查

检查寄主的树皮、枝条等组织有无子座、子囊壳，在显微镜下观察病菌的子囊壳，记录其形态特征，

测量子囊和子囊抱子的大小。所获得分离物在马铃薯葡萄糖琼脂培养基进行单抱分离纯化。

7.2.3组织中病原菌的分离和培养

如果发现可疑症状，但不能按7.2.2进行有性型形态检查，应采取下列分离培养的方法做进一步的

鉴定。剥去树皮，纵向劈开树干露出内部溃疡的边缘。在无菌条件下，从溃疡部分的外部边缘切取

1cm?的薄木片，放在0.5%次氯酸钠溶液中浸泡2min〜5min,用无菌水重复洗3次，然后用无菌滤纸

吸干，放在选择性培养基上进行培养。24°C培养4d〜7d后，将疑似菌落转到马铃薯葡萄糖琼脂培养

基上进行分离纯化。

8鉴定特征

&1PCR凝胶电泳初筛检测

判定结果见附录Bo

&2培养性状

葡萄藤猝倒病菌在PDA培养基首先形成白色棉絮状菌丝，培养基背面奶油色。2周后，培养基上

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GB/T33119—2016

出现灰色色素，培养基背面变成黑色。3周〜4周后，在连续的光照培养下，形成小的黑色的分生抱子

器。分生抱子丝状，直或弯曲，数量多，大小（20m〜45/am）X（0.8