GB/T 18869-2019 饲料中大肠菌群的测定

ICS65.120

B46

中华人民共和国国家标准

/—

GBT188692019

代替/—

GBT188692002

饲料中大肠菌群的测定

Determinationofcoliformsinfeeds

2019-06-04发布2020-01-01实施

国家市场监督管理总局

发布

中国国家标准化管理委员会

/—

GBT188692019

前言

本标准按照/—给出的规则起草。

GBT1.12009

本标准代替/—《饲料中大肠菌群的测定》。

GBT188692002

/—,:

本标准与GBT188692002相比主要技术内容修改如下

———(,);

修改了适用范围见第章年版的第章

120021

———();

增加了术语和定义见第章

3

———(,);

修改了原理的描述见第章年版的第章

420023

———()。

增加了LST发酵法见8.3

本标准由全国饲料工业标准化技术委员会(/)提出并归口。

SACTC76

:[

本标准起草单位中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所国家饲料质量监督检验中心

()]。

北京

:、、、。

本标准主要起草人李丽蓓刘晓露李胜王彤

本标准的历次版本发布情况为:

———/—。

GBT188692002

Ⅰ

/—

GBT188692019

饲料中大肠菌群的测定

1范围

本标准规定了饲料中大肠菌群的测定方法。

本标准适用于饲料和饲料添加剂中大肠菌群的测定。

2规范性引用文件

。,

下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件仅注日期的版本适用于本文

。,()。

件凡是不注日期的引用文件其最新版本包括所有的修改单适用于本文件

/分析实验室用水规格和试验方法

GBT6682

3术语和定义

下列定义适用于本文件。

3.1

大肠菌群coliforms

在一定培养条件下能发酵乳糖产酸产气的需氧或兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌。

3.2

最可能数;

mostrobablenumberMPN

p

基于泊松分布的一种间接计数方法。

4原理

,,

将待测样品稀释至适当浓度并培养后根据其未生长的最低稀释度与生长的最高稀释度应用统计

,。

学概率论推算表查出待测样品中大肠菌群的最大可能数

5培养基或材料

,。

除非另有说明在分析中仅使用确认为分析纯的试剂

:/。

5.1水符合GBT6682中三级水的要求

:。

乳糖胆盐发酵培养基见附录中

5.2AA.1

:。

伊红美蓝琼脂见附录中

5.3AA.2

:。

乳糖发酵培养基见附录中

5.4AA.3

:。

革兰氏染色液见附录中

5.5AA.4

(,):。

月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤见附录中

5.6laurlsulfatetrtoseLSTAA.5

yyp

(,):。

煌绿乳糖胆盐肉汤见附录中

5.7brilliantreenlactosebileBGLBAA.6

g

:。

磷酸盐缓冲液见附录中

5.8AA.7

:。

无菌生理盐水见附录中

5.9AA.8

1

/—

GBT188692019

氢氧化钠溶液:()/。见附录中。

5.10cNaOH=1molLAA.9

盐酸溶液:()/。见附录中。

5.11cHCl=1molLAA.10

6仪器设备

:。

6.1天平感量0.1g

恒温培养箱:。

6.236℃±1℃

:()、()。

无菌吸管具刻度具刻度或微量移液器及吸头

6.31mL0.01mL10mL0.1mL

:。

6.4无菌锥形瓶容量500mL

6.5均质器。

6.6振荡器。

:。

6.7显微镜普通生物显微镜

6.8H计或精密H试纸。

pp

7样品

7.1采样原则

、。,

样品的采集应遵循随机性代表性的原则采样过程应遵循无菌操作程序防止一切可能的外来

污染。

7.2采样方法

,,

7.2.1应在同一批次产品中采集样品每件样品的采样量应满足微生物指标检验的要求一般不少于

()。

500mL

g

、、,。

7.2.2独立包装小于等于500g的固态产品或小于等于500mL的液态产品取完整包装

,,

7.2.3独立包装大于500mL的液态产品应在采样前摇动或用无菌棒搅拌液体使其达到均质后采集

,。

适量样品放入同一个无菌采样容器内作为一件样品

,,

7.2.4独立包装大于500g的固态产品应用无菌采样器从同一包装的不同部位分别采取适量样品放

入同一个无菌采样容器内作为一件样品。

7.3采集样品的贮存和运输

7.3.1应尽快将样品送往实验室检验。

7.3.2应在运输过程中保持样品完整。

,。

7.3.3应在接近原有贮存温度条件下贮存样品或采取必要措施防止样品中微生物数量的变化

8试验方法

8.1试验方法类别

,

本标准试验方法分为乳糖胆盐发酵法和LST发酵法乳糖胆盐发酵法适用于限量要求以

/()为单位的产品,发酵法适用于限量要求以/()为单位的产品。

MPN100mLLSTMPNmL

gg

8.2乳糖胆盐发酵法

8.2.1试样的稀释

:,

8.2.1.1固态和半固态样品称取25g试样放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质

2

/—

GBT188692019

,//,

杯8000rmin~10000rmin均质1min~2min或放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无

,,。

菌均质袋中用拍击式均质器拍打制成倍稀释的样品匀液

1min~2min10

:,,。

注含有硬物的原料如肉骨粉等里面含骨渣易扎破均质袋不宜用拍击式均质器

:

8.2.1.2液态样品以无菌吸管吸取25mL样品置于盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥

(),,,

形瓶瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠或其他无菌容器中置于振荡器中振荡充分混匀制成倍稀

10

释的样品匀液。

:。

注黏稠样品宜采用固态称量法

,

用无菌吸管或微量移液器吸取倍稀释的样品匀液沿管壁缓缓注入磷酸

8.2.1.31mL101mL9mL

(),

盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中注意吸管和吸头尖端不要触及稀释液面振摇试管或换一只1mL

,,。

无菌吸管反复吹打使其混合均匀制成100倍稀释的样品匀液

,,。

8.2.1.4根据对样品污染状况的估计按上述操作依次制成十倍递增系列稀释样品匀液每递增稀释

,。,。

一次换一只1mL无菌吸管或吸头从制备样品匀液至样液接种完毕全过程不超过15min

8.2.2乳糖发酵试验

(),

每个样品选择个适宜的连续稀释度的样品匀液液体样品可以选择原液每个稀释度接种管

33

,(,),

乳糖胆盐发酵管每管接种1mL如接种量超过1mL则用双料乳糖胆盐发酵管置36℃±1℃培养

,,,,,

箱内培养24h±2h观察倒管内是否有气泡产生如未产气则可报告为大肠菌群阴性如有产气者则

按和程序进行操作。

8.2.38.2.4

8.2.3分离培养

,,,

将产气的发酵管分别接种在伊红美蓝琼脂平板上置36℃±1℃培养箱内培养18h~24h然后

,,。

取出观察菌落形态并做确证试验

8.2.4确证试验

,,,

在上述平板上挑取可疑菌落个个进行革兰氏染色同时接种乳糖发酵管置培

1~236℃±1℃

,,。、,

养箱内培养24h±2h观察产气情况凡乳糖管产气革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌即可报告大

肠菌群为阳性。

8.2.5试验程序图

乳糖胆盐发酵法试验程序图见附录B。

8.3LST发酵法

8.3.1试样的稀释

操作同8.2.1。

8.3.2初发酵试验

(),

每个样品选择个适宜的连续稀释度的样品匀液液体样品可以选择原液每个稀释度接种管

33

,(,),,

LST肉汤每管接种1mL如接种量超过1mL则用双料LST肉汤36℃±1℃培养24h±2h观察

,(),,

倒管内是否有气泡产生24h±2h产气者进行复发酵试验证实试验如未产气则继续培养至48h±2h

。。

产气者进行复发酵试验未产气者为大肠菌群阴性