DB15/T 3151-2023 酶消化法制备奶牛乳腺上皮细胞及其RNA提取技术规程

ICS65.020.30

CCSB44

15

内蒙古自治区地方标准

DB15/T3151—2023

酶消化法制备奶牛乳腺上皮细胞及其

RNA提取技术规程

Technicalproceduresforpreparationbyenzymedigestionmethodand

RNAextractionofbovinemammaryepithelialcells

2023-08-25发布2023-09-25实施

内蒙古自治区市场监督管理局发布

DB15/T3151—2023

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC19）归口。

本文件起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院。

本文件主要起草人：宋洁、王丽芳、胡耀、张腾龙、郭晨阳、钟华晨、刘嘉琳、杨健、狄彩霞、羿

静、肖豆鑫、吴海霞、王春和、田志国、王利平、高新发、王晓辉、常月明、杨竹鸣、石文奎、褚文彬、

马跃。

I

DB15/T3151—2023

酶消化法制备奶牛乳腺上皮细胞及其

RNA提取技术规程

1范围

本文件规定了奶牛乳腺上皮细胞培养及其RNA提取和质量鉴定的方法。

本文件适用于Ⅱ型胶原酶法制备奶牛乳腺上皮细胞及其RNA提取和质量鉴定。

2规范性引用文件

本文件没有规范性引用文件。

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

奶牛乳腺上皮细胞bovinemammaryepithelialcells

奶牛乳腺组织中唯一可以合成和分泌乳汁的高度分化的功能细胞。

角蛋白-18cytokeratin18（CK18）

上皮细胞特有的标志蛋白。

4试剂和材料

试验试剂

DMEM/F12培养基、胎牛血清（FBS）、青链霉素混合液（含有10000unit/mL青霉素和10000ug/mL

链霉素）、胰岛素转铁蛋白硒、氢化可的松、两性霉素B、表皮生长因子、胶原酶Ⅱ、0.25%胰蛋白酶、

二甲基亚砜（DMSO）、磷酸盐缓冲液（PBS）、75%酒精、4%多聚甲醛、0.3%曲拉通（TritonX－100）、

5%正常山羊血清、兔抗角蛋白18抗体、山羊抗兔IgG、4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）、甘油、TRNzol

裂解液、氯仿、异丙醇、无水乙醇、ddH2O、西班牙琼脂糖、50×TAE、DNA片段标准参照物（DNAMarker

DL5000）、通用电泳加样缓冲液（6×LoadingBuffer）、核酸染料、反转录试剂盒、实时荧光定量（RT-

PCR）试剂盒。

试剂配制

4.2.13×PBS缓冲液：1×PBS缓冲液（500mL）中加入3mL青链霉素混合液，4℃低温保存。

4.2.26×PBS缓冲液：1×PBS缓冲液（500mL）中加入6mL青链霉素混合液，4℃低温保存。

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DB15/T3151—2023

4.2.3Ⅱ型胶原酶（0.5%）：称取75mgⅡ型胶原酶，在灭菌烧杯中加15mLPBS缓慢吹打溶解，

0.22μm针式过滤器过滤，现配现用。

4.2.4氢化可的松（0.1mg/mL）：1mg氢化可的松溶于1mL乙醇溶液中，充分混匀至粉末完全溶解，

用1×PBS定容至10mL，用0.22μm滤膜过滤后，按每管1mL分装，封口冻存于-20℃。

4.2.5两性霉素B（2.5mg/mL）：25mg两性霉素B粉末溶于10mL三蒸水中，吹打溶解后用0.22

μm针式过滤器过滤，按每管1mL分装，封口冻存于-20℃。

4.2.6表皮生长因子（10μg/mL）：将0.1mg的表皮生长因子溶解在10mL的PBS中，按每管1

mL分装，封口冻存于-20℃。

4.2.7完全培养基：将90mLDMEM/F12培养基、10