DB62/T 4094-2020 草品种真实性检验规程 SSR 标记法

ICS65.120

B25

DB62

甘肃省地方标准

DB62/T4094—2020

草品种真实性检验规程SSR标记法

RulesforvarietygenuinenesstestingofherbaceousplantSSRmarkermethod

2020-03-16发布2020-04-01实施

发布

DB62/T4094—2020

目次

前言................................................................................II

1范围..............................................................................1

2规范性引用文件....................................................................1

3术语和定义........................................................................1

4原理..............................................................................1

5试验样品..........................................................................2

6仪器设备及试剂....................................................................2

7溶液配制..........................................................................2

8引物信息..........................................................................2

9操作程序..........................................................................2

10数据记录与统计...................................................................4

11结果判定方法.....................................................................4

附录A（规范性附录）主要仪器设备及试剂..............................................5

附录B（规范性附录）溶液配制........................................................7

附录C（规范性附录）引物信息........................................................9

附录D（资料性附录）参照品种信息...................................................12

附录E（规范性附录）凝胶配制.......................................................14

附录F（资料性附录）SSR标记电泳图谱...............................................15

附录G（规范性附录）数据统计记录表.................................................21

I

DB62/T4094—2020

前言

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。

本标准由甘肃省林业和草原局提出并负责监督实施。

本标准由甘肃省草业标准化技术委员会归口。

本标准起草单位：兰州大学草地农业科技学院，农业农村部牧草与草坪草种子质量监督检验测试中

心（兰州），全国畜牧总站，甘肃省草原技术推广总站。

本标准主要起草人：刘文献，谢文刚，闵学阳，齐晓，邵麟惠，陈志宏，向金城。

II

DB62/T4094—2020

草品种真实性检验规程SSR标记法

1范围

本标准规定了利用SSR（SimpleSequenceRepeat，简单序列重复）标记进行紫花苜蓿（Medicagosativa

L.）、杂花苜蓿（MedicagovariaMartyn）及箭筈豌豆（ViciasativaL.）品种鉴定的试验分析、数据采集

及结果判定方法。

本标准适用于基于SSR标记的紫花苜蓿、杂花苜蓿及箭筈豌豆品种DNA分子数据采集及品种鉴定。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T2930.4草种子检验规程发芽试验

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

品种真实性varietygenuineness

送检品种与文件记录（如标签等）或所述品种是否相符。

3.2

参照品种referencevariety

代表核心位点主要等位变异的一组样品。参照品种用于辅助比对待测样品在某个SSR位点上等位变

异扩增片段的大小，校正不同仪器设备的系统误差。

3.3

DNA分子标记DNAmarker

个体间遗传物质核苷酸序列的可遗传变异，是DNA水平遗传多态性的直接反映。

3.4

SSR分子标记simplesequencerepeatmarker

基因组中由1～6个核苷酸为基本单位组成的多次简单串联重复序列标记。

4原理

SSR广泛分布于植物基因组的不同位置，且因不同品种间单个SSR位点重复单位数量的不同而存在

多态性，是一种应用广泛的DNA分子标记。这种多态性序列两侧的序列高度保守且为单拷贝，可根据其

序列设计一对特异引物，通过PCR扩增检测不同样品DNA间的特异片段。因此，根据比较送检样品与比

对样品的特异片段可对紫花苜蓿、杂花苜蓿及箭筈豌豆品种进行鉴定。

1

DB62/T4094—2020

5试验样品

5.1样品种类

送检样品为种子或叶片组织。

5.2样品的要求

供试样品由委托检验的单位、组织或个人提供，包括送检样品和比对样品。比对样品为已通过审定

的品种时，其样品由政府相关管理部门或该部门指定机构提供。比对样品为委托人提供的品种时，检测

结果仅表示送检样品与比对样品是否为同一品种，不提供品种真实性判断。

送检样品种子数至少2000粒且发芽率不低于80%。随机选取200粒～300粒送检样品种子，按照

GB/T2930.4规定的纸上发芽床方法进行萌发。种子萌发10天后，等量采取40个苜蓿单株或10个箭筈豌

豆单株叶组织进行混合（1.0g～2.0g）。当送检样品为生长在大田的叶片组织时，可由扦样员到田间取

样。取样的地块由委托检验的单位、组织或个人指定，采用棋盘式取样法，等量采取40个苜蓿单株或

10个箭筈豌豆单株叶组织进行混合（1.0g～2.0g），保存于硅胶干燥器或液氮中。每个品种采取2份混

合样品。

6仪器设备及试剂

仪器设备及试剂见附录A。

7溶液配制

溶液配制方法见附录B，所用试剂均为分析纯。

8引物信息

引物信息表见附录C。

9操作程序

9.1DNA提取

混合叶组织在液氮中充分研磨后移入2.0mL离心管中。每管加入700µLDNAbuffer溶液，混合均

匀，65℃水浴10min，期间颠倒混匀2～3次；冷却至室温，加195µL5MKAc，冰上放置5min。在通

风橱内加入600µL24:1氯仿-异戊醇（V:V），颠倒混匀，12000r/min，室温离心10min，吸取上清液至

新的离心管。在上清液中加入36µL3MNaAc和240µL异丙醇，混合均匀，室温放置10min，12000r/min

离心10min，弃上清液；加入500µL75%乙醇，将沉淀弹起，离心2min，倒出乙醇；接着12000r/min

离心30s～40s，并用10µL移液枪将残液吸出。通风橱中将残留的乙醇挥发彻底，之后加入20µLddH2O

溶解混匀。用Nanodrop分光光度计测定DNA浓度和质量（OD260/OD280≈1.8），吸取部分原液稀释成

50ng/µL的工作液，4℃保存。参照品种（附录D）的取样与DNA提取与送检样品同样方法处理。

9.2PCR扩增

9.2.1反应体系

2

DB62/T4094—2020

PCR反应体系为10μL，在PTC-200热循环仪上进行：模板DNA1μL(50ng/μL)，PCRMix5μL，

Tap酶0.1μL，正反向引物各1μL(10μmol/L)，其余用ddH2O补足至终体积。如果PCR过程中不采用热盖

程序，则反应液上覆盖15μL矿物油。

9.2.2反应程序

94℃预变性3min；94℃变性30s，56℃或57℃退火30s，72℃延伸45s，30～35个循环数；72℃

延伸7min；4℃保存。每对引物重复2次PCR反应。

9.3PCR产物的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳与银染检测

9.3.1清洗玻璃板

将玻璃板清洗干净，用去离子水冲洗后晾干。用95%乙醇擦洗两遍，吸水纸擦干。操作过程中防止

两块玻璃板互相污染。

9.3.2组装玻璃板

待玻璃板彻底干燥后，将其组装成电泳胶板，用水平仪调平。

9.3.3制胶

在100mL6.0%的非变性聚丙烯酰胺凝胶母液中分别加入67µLTEMED和新配制的10%过硫酸铵

溶液1.0mL（附录E），迅速混匀后灌胶，灌胶时应匀速以防止出现气泡。待胶液充满玻璃板夹层，在

上部轻轻插入梳子，室温聚合1h以上。胶聚合后，清理胶板表面溢出的胶液，轻轻拔出梳子，用水清洗

干净备用。

9.3.4预电泳

将胶板安装于电泳槽上，盖上电泳槽电极盖，在正极槽和负极槽（上下）加入1×TBE缓冲液，使

其超出凝胶顶部越2cm～3cm。在200V恒压下，预电泳20min～30min，使凝胶预热。

9.3.5电泳

用注射器吸取缓冲液冲洗凝胶顶端几次，清除气泡和凝胶碎片，同时将胶条拨正。每一个加样孔点

入2µL～4µL样品。除待测样品外，同时加入参照品种扩增产物。在200V恒压下电泳，电泳1.5h～

2.5h（电泳时间取决于扩增片段的大小范围）。电泳结束后，小心分开两块玻璃板，从玻璃板上取下凝

胶准备银染。

9.3.6银染

银染的操作过程具体如下：

a)固定：将凝胶置于固定液中，附着凝胶面朝上，使固定液没过凝胶，在摇床上轻轻晃动20min～

30min；

b)漂洗：取出凝胶，在蒸馏水中漂洗1次～2次；

c)染色：将凝胶置于染色液中，使染色液没过凝胶，在摇床上轻轻晃动10min～15min；

d)漂洗：取出凝胶，在蒸馏水中漂洗1次，不超过10s；

e)显影：将凝胶置于显影液中，使显影液没过凝胶，轻轻晃动至出现清晰带纹；

f)定影：将凝胶置于固定液中，使固定液没过凝胶，定影5min；

g)漂洗：取出凝胶，在去离子水中漂洗1min。

3

DB62/T4094—2020

9.3.7拍照

凝胶拍照结果模式参见附录F。

10数据记录与统计

以1，0形式代表同一分子量大小条带的有无，记录送检样品和比对样品在所有位点的DNA电泳谱

带数据，按照附录G统计送检样品和比对样品的差异位点，差异等位变异数，并统计相似度。

11结果判定方法

首先根据附录C中前半数引物的扩增结果，对送检样品和比对样品的相似度进行比较。当样品间相

似度小于等于90%时，则认定为“不同品种”；当样品间相似度大于90%时，继续利用附录C中剩余的引物

进行扩增检测，最终根据相似度值判定为“不同品种”、“近似品种”或者“疑同品种”。具体判定方法如下：

a)比对结果相似度S≤90%，判定为“不同品种”；

b)比对结果相似度90%<S<100%，判定为“近似品种”；

c)比对结果相似度S=100%，判定为“疑同品种”。

品种相似度S按照（1）进行计算。

∑100........................................................................(1)

式中：

S——相似度，%；

Nij——品种i和j之间共同的电泳条带数目；

Ni——品种i中出现的电泳条带数目；

Nj——品种j中出现的电泳条带数目；

n——SSR标记数目。

4

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AA

附录A

（规范性附录）

主要仪器设备及试剂

A.1主要仪器设备

A.1.1通用实验室仪器设备。

A.1.2PCR扩增仪（96孔）。

A.1.3水浴锅或金属浴。

A.1.4垂直电泳槽及配套的制胶配件。

A.1.5高压电泳仪。

A.1.6单道移液器（10µL、20µL、50µL、100µL、200µL、1000µL）。

A.1.7水平摇床。

A.1.8胶片观察灯。

A.1.9磁力搅拌器。

A.1.10酸度计。

A.1.11电子天平。

A.1.12高压灭菌锅。

A.1.13制冰机。

A.1.14冰箱。

A.1.15照相机。

A.2主要试剂

A.2.1乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA）。

A.2.2三羧甲基氨基甲烷（Tris）。

A.2.3浓盐酸。

A.2.4氢氧化钠。

A.2.5氯化钠。

A.2.6石蜡油。

A.2.7去离子甲酰胺。

A.2.8溴酚蓝。

A.2.9二甲苯青。

A.2.10十二烷基磺酸钠。

A.2.11三氯甲烷。

A.2.12异戊醇。

A.2.13异丙醇。

A.2.14N’-N’甲叉双丙烯酰胺（Bis）。

A.2.15丙烯酰胺（Acr）。

A.2.16硼酸。

A.2.17尿素。

5

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A.2.18亲和硅烷。

A.2.19剥离硅烷。

A.2.20无水乙醇。

A.2.21四甲基乙二胺（TEMED）。

A.2.22过硫酸铵（(NH3)2S2O3）。

A.2.23冰醋酸。

A.2.24硝酸银。

A.2.25甲醛。

A.2.2610×PCRBuffer。

A.2.27PCR-Mix（天庚）。

A.2.28TaqDNA聚合酶。

A.2.29SSR引物。

A.2.30去离子水。

A.2.31聚丙烯酰胺胶液。

A.2.32DNA分析用分子量标记。

6

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BB

附录B

（规范性附录）

溶液配制

B.1DNA提取溶液的配制

B.1.11mol/L氢氧化钠溶液

称取40.0g氢氧化钠，溶于800mL水中，冷却至室温，定容至1000mL。

B.1.20.5mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液（PH8.0）

称取186.1g二水合乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA•2H2O），加入800mL水，再加入20g氢氧化钠，

搅拌。待乙二胺四乙酸二钠盐完全溶解后，冷却至室温。再用氢氧化钠溶液（1mol/L）准确调PH至8.0，

定容至1000mL，高压灭菌20min（103.4kPa，121℃）。

B.1.31mol/L的Tris-HCl溶液

称取12.11g三羟甲基氨基甲烷（NH2C(CH2OH)3）溶于适量水中，加HCl调pH至8.0，加水定容至

100mL，高压灭菌。

B.1.40.5mol/L的HCL溶液

量取25mL36%～38%浓盐酸，加水定容至500mL。

B.1.510%SDS提取液

称取10gSDS溶于70mLddH2O中，50℃水浴溶解后，ddH2O定容至100mL。

B.1.6DNAbuffer

在400mLddH2O中依次加入：100mL1M（PH=8.0）的Tris-HCl，100mL0.5M（PH=8.0）的

EDTA，100mL5MNaCl，200mL10%SDS，ddH2O定容至1000mL。

B.1.75MKAc

称取49.07gKAc，溶解到90mLddH2O中，用HAC调节PH=6，ddH2O定容至100mL。

B.1.83MNaAc

称取24.6gNaAc，溶解到90mLddH2O，用HAC调