T/FDCA 008-2023 化妆品温和（无刺激）功效评价-斑马鱼胚胎尾鳍切口中性粒细胞测试方法

范围:本文件提供了利用斑马鱼胚胎评价化妆品温和（无刺激）性能的测试方法。 本文件适用于化妆品及其原料的温和（无刺激）功效评价; 主要技术内容:7 实验方法7.1 受试生物选用健康的3天大（受精后72h）野生型纯品系或中性粒细胞荧光标记的斑马鱼（Danio rerio）胚胎。7.2 受试物准备7.2.1 水溶性原料/产品：可用鱼胚胎培养液直接将受试物溶解配制成测试溶液。7.2.2 非水溶性原料/产品：可选常用溶剂如甲醇、二甲基亚砜、乙醇等助溶。如将受试物和有机溶剂按1：1（重量g：体积mL）混匀，超声处理10min，然后加入鱼胚胎培养液配制成所需浓度，震荡30s。如有颗粒物质存在，则于6,500rpm 离心10min，取上清液进行测试。驻留型产品测试浓度为1g/L，淋洗类产品测试浓度为0.01g/L。7.3 测试步骤测试流程可参考附录A图A.1。7.3.1 损伤模型使用三卡因溶液麻醉斑马鱼胚胎，于显微镜下用实验解剖刀在尾巴末端尾鳍起始处切个切口（附录B图B.1）。7.3.2 测试分组测试应设定模型对照组、刺激对照组和受试物组。如用到助溶剂，各测试组应含相同浓度的助溶剂。模型对照组：随机挑选24尾损伤模型鱼胚胎至3cm培养皿中，暴露于5mL鱼胚胎培养液。刺激对照组：随机挑选24尾损伤模型鱼胚胎至3cm培养皿中，暴露于5mL十二烷基硫酸钠溶液。受试物组：随机挑选24尾损伤模型鱼胚胎至3cm培养皿中，暴露于5mL受试物溶液。放置于28℃±1℃恒温箱中培养3h±0.25h。于显微镜下观察鱼胚胎，一分钟内心脏没有跳动的鱼胚胎判定为死亡，统计鱼胚胎死亡数。7.3.3 苏丹黑染色如采用中性粒细胞荧光标记斑马鱼胚胎进行测试，不用进行苏丹黑染色，直接进行7.3.4结果观察和计算。如采用野生型斑马鱼胚胎进行测试，则进行下面苏丹黑染色。首先，将每组试验鱼胚胎用多聚甲醛固定1h后，用PBST浸泡鱼胚胎3次，每次5min，然后用50%乙醇浸泡3min。其次，用苏丹黑染色溶液对鱼胚胎进行室温染色1h后，用70%乙醇浸泡4次，每次5min，然后用PBST浸泡2次，每次5min。最后，用漂白溶液浸泡鱼胚胎10min，如在试管里浸泡，则应保持盖子打开。然后用70%乙醇溶液浸泡5min，PBST浸泡1min，用清透液1浸泡15min，清透液2浸泡10min，再用PBST浸泡3min。7.3.4 结果观