DB1307/T 300-2020 “张杂谷”品种分子鉴定技术规程

B22

DB1307

张家口市地方标准

DB1307/T300—2020

“张杂谷”品种分子鉴定技术规程

2020-01-06发布2020-01-21实施

张家口市市场监督管理局发布

DB1307/T300—2020

前言

本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。

本标准由张家口市农业科学院提出。

本标准起草单位：张家口市农业科学院、北京市农林科学院、河北巡天农业科技有限公司。

本标准主要起草人：赵治海、魏玮、李双东、范光宇、王凤格、赵久然、易红梅、王蕊、叶世峰、

李素军、朱成平、刘粤阳、杨建勇、赵芳、张晓磊、冯小磊、王晓明、王峰、史高雷、宋国亮、王德权、

张雅莉、李欣儒、张文英、邱风仓、裴晶晶。

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“张杂谷”品种分子鉴定技术规程

1范围

本标准规定了采用微卫星标记进行“张杂谷”品种分子鉴定的术语和定义、原理、仪器设备、试剂

及溶液配制、引物信息、参照品种信息、操作程序、数据记录与统计、判定规则等技术要求。

本标准适用于“张杂谷”品种分子鉴定。

2术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

2.1

核心引物

品种鉴定中优先选用的一套SSR（simplesequencerepeat）引物，具有多态性高、重复性好等特点。

2.2

参照品种

所用的SSR标记能够扩增出稳定、清晰、可辨的等位变异的品种。参照品种用于辅助确定待测样

品的等位变异，校正实验操作、仪器设备的系统误差。

3原理

由于不同谷子品种遗传组成不同，基因组DNA中简单重复序列的重复次数存在差异，利用微卫星标

记技术可鉴定不同谷子品种及来源。

4仪器设备

仪器设备见附录A。

5试剂及溶液配制

试剂及溶液配制见附录B。

6引物信息

引物信息核心引物名单及序列表见附录C，核心引物等位变异等相关信息见附录D。

7参照品种信息

参照品种信息见附录E。

1

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8操作程序

8.1取样

送验样品可为种子、幼苗、叶片、果穗等组织或器官。对谷子材料随机数取至少5个个体组成混合

样品进行分析。

8.2DNA提取

8.2.1CTAB提取法：幼苗或叶片约200mg~300mg，置于2.0mL离心管，加液氮冷冻，充分研磨，或

取种子充分磨碎，移入2.0mL离心管；每管加入700µL65℃预热的CTAB提取液后，充分混合，65℃

保温60min，期间多次颠倒混匀；每管加入等体积的三氯甲烷/异戊醇混合液，充分混合后，静置10min；

12000rpm离心15min，取上清液，加入等体积预冷的异丙醇，颠倒离心管数次，-20℃放置30min；

4℃，12000rpm离心10min，弃上清液；加入70%乙醇，旋转离心管数次，弃去乙醇；将离心管倒立

于垫有滤纸的实验台上，室温干燥沉淀6h以上；加入100µL超纯水或TE缓冲液，充分溶解后备用。

8.2.2也可使用其它达到PCR扩增质量要求的DNA提取方法。

8.3PCR扩增

8.3.1引物选择

首先选择附录C中第1~18对引物进行检测，当样品间检测出的差异位点数小于2时，再选用附录C中

第19~36对引物进行检测。

8.3.2反应体系

各组分的终浓度如下：每种dNTP0.10mmol/L，上游、下游引物各0.24mol/L，TaqDNA聚合酶0.04

U/l，1倍PCR缓冲液（含Mg2+2.5mmol/L），DNA浓度2.5ng/l，其余以超纯水补足至所需体积。

8.3.3反应程序

94℃预变性5min，1个循环；94℃变性40s，60℃退火35s，72℃延伸45s，共35个循环；72℃延

伸10min，4℃保存。

8.4PCR产物检测

8.4.1变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）法

8.4.1.1清洗玻璃板

用清水沾洗涤灵将玻璃板反复擦洗干净，双蒸水擦洗两遍，95%乙醇擦洗两遍，干燥。在长板上涂

上0.5mL亲和硅烷工作液，带凹槽的短板上涂0.5mL剥离硅烷工作液。操作过程中防止两块玻璃板互

相污染。

8.4.1.2灌胶

在100mL4.5%PAGE胶中加入TEMED和25%过硫酸铵各100L，迅速混匀后灌胶。待胶流动到下

部，在上部轻轻的插入梳子，使其聚合1h以上。灌胶时应匀速防止出现气泡。

8.4.1.3预电泳

在正极槽（下槽）中加入1倍TBE缓冲液600mL，在负极槽（上槽）加入预热至65℃的1倍TBE缓冲

液600mL，拔出梳子。90W恒功率预电泳10~20min。

2

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8.4.1.4变性

在20LPCR产物中加入4L6倍加样缓冲液，混匀后，在PCR仪上运行变性程序：95℃变性5min，

4℃冷却10min以上。

8.4.1.5电泳

用移液器吹吸加样槽，清除气泡和杂质，插入样品梳子。每一个加样孔点入5l样品。80W恒功

率电泳至上部的指示带（二甲苯青FF）到达胶板的中部。电泳结束后，分开两块玻璃板。

注：预期扩增产物片段大小在150bp以下时电泳时间应适当缩短，扩增产物片段大小在300bp以上时电泳时间应适

当延长。

8.4.1.6银染

银染按以下步骤进行：

a）固定：固定液中轻轻晃动3min；

b）漂洗：双蒸水快速漂洗1次，不超过10s；

c）染色：染色液中染色5min；

d）漂洗：双蒸水快速漂洗，时间不超过10s；

e）显影：显影液中轻轻晃动至带纹出现；

f）定影：固定液中定影5min；

g）漂洗：双蒸水漂洗1min。

8.4.2荧光标记毛细管电泳

8.4.2.1样品制备

等体积混合不同荧光SSR标记（FAM，ROX）扩增产物，混匀后从混合液中吸取1L加入到DNA

分析仪专用96孔板孔中。板中各孔分别加入0.1L分子量内标和8.9L去离子甲酰胺。将样品在PCR仪

上95℃变性5min，取出，立即置于碎冰上，冷却10min以上。离心10s后置放到DNA分析仪上。

8.4.2.2电泳检测

按照仪器操作手册，编辑样品表，执行运行程序，保存数据。

9数据记录与统计

9.1数据记录

对普通变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，将每个扩增位点的等位变异与参照品种的等位变异片段大小进行

比较，确定样品在该位点的等位变异；对荧光标记毛细管电泳，通过参照品种消除同型号不同批次间或

不同型号DNA分析仪间可能存在的系统误差，使用片段分析软件读取样品在该位点的等位变异。

纯合位点的基因型数据记录为X/X，杂合位点的基因型数据记录为X/Y，其中X、Y分别为该位点

上两个等位变异，小片段数据在前，大片段数据在后；缺失位点基因型数据记录为0/0。

示例1：样品在某个位点上仅出现一个等位变异，为150，在该位点的基因型记录为150/150；

示例2：样品在某个位点上有两个等位变异，分别为150、160，在该位点的基因型记录为150/160。

9.2数据统计

当对送验样品混合DNA进行分析时，可直接进行品种间成对比较，如果样品某个引物位点出现可

3

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见的异质性且影响到差异位点判定时，可重新提取至少20个个体的DNA，并用该引物重新扩增，统计

在该引物位点上不同个体的基因型（或等位变异）及所占比例。当对送检样品多个个体DNA进行分析

时，应统计其在各引物位点的各种基因型（或等位变异）及所占比例。对单交种，应比较两个样品在各

引物位点的基因型；对自交系，应比较两个样品在各引物位点的等位变异。

成对比较的数据统计记录表见附录F。

10判定规则

10.1结果判定

当样品间差异位点数≥2，判定为“不同”；当样品间差异位点数＝1，判定为“近似”；当样品间

差异位点数＝0，判定为“极近似或相同”。

对利用附录C中36对引物仍未检测到≥2个差异位点数的样品，如果相关品种存在特定标记，必要时

增加其特定标记进行检测。

10.2结果表述

比较位点数：，比较位点为：；差异位点数：，差异位点为：；判

定为：。

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AA

附录A

（规范性附录）

主要仪器设备及试剂

A.1主要仪器设备

A.1.1PCR扩增仪

A.1.2高压电泳仪

规格为3000V、400mA、400W，具有恒电压、恒电流和恒功率功能。

A.1.3垂直电泳槽及配套的制胶附件

A.1.4普通电泳仪

A.1.5水平电泳槽及配套的制胶附件

A.1.6高速冷冻离心机

最大离心力不小于15000rpm，-10℃~30℃。

A.1.7水平摇床

A.1.8胶片观察灯

A.1.9电子天平

感应为0.01g、0.001g。

A.1.10微量移液器

规格分别为10L、20L、100L、200L、1000L，连续可调。

A.1.11磁力搅拌器

A.1.12紫外分光光度计

波长260nm及280nm。

A.1.13微波炉

A.1.14高压灭菌锅

A.1.15酸度计

A.1.16水浴锅或金属浴

控温精度±1℃。

A.1.17冰箱

最低温度-20℃。

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A.1.18制冰机

A.1.19凝胶成像系统或紫外透射仪

A.1.20DNA分析仪

基于毛细管电泳，有片段分析功能和数据分析软件，能够分辨1个核苷酸大小的差异。

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BB

附录B

（规范性附录）

溶液配制

B.1主要试剂

B.1.1十六烷基三乙基溴化铵（CTAB）

B.1.2三氯甲烷

B.1.3异丙醇

B.1.4异戊醇

B.1.5乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2•2H2O）

B.1.6三羟甲基氨基甲烷（Tris-base）

B.1.7盐酸（HCI）：37%

B.1.8氢氧化钠（NaOH）

B.1.9氯化钠(NaCl)

B.1.1010倍PCRBuffer缓冲液

含Mg2+25mmol/L

B.1.11四种脱氧核苷三磷酸

dATP、dTTP、dGTP、dCTP（每种10mmol/L）

B.1.12TaqDNA聚合酶

B.1.13矿物油

B.1.14琼脂糖

B.1.15DNA分子量标准

B.1.16核酸染色剂

B.1.17去离子甲酰胺

B.1.18溴酚蓝

B.1.19二甲苯青FF

B.1.20甲叉双丙烯酰胺

B.1.21丙烯酰胺

B.1.22硼酸

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B.1.23尿素

B.1.24亲和硅烷

B.1.25剥离硅烷

B.1.26无水乙醇

B.1.27四甲基乙二胺

B.1.28过硫酸铵

B.1.29冰醋酸

B.1.30乙酸铵

B.1.31硝酸银

B.1.32甲醛

B.1.33DNA分析仪专用丙烯酰胺胶液

B.1.34DNA分析仪专用分子量内标Liz标记

B.1.35DNA分析仪专用电泳缓冲液

B.2DNA提取溶液的配制

B.2.10.5mol/LEDTA溶液

称取186.1gNa2EDTA.2H2O溶于800mL水中，加固体氢氧化钠调pH值至8.0，定容至1000mL，高

压灭菌。

B.2.21mol/LTris-HCl溶液

称取60.55gTris碱溶于水中，加HCl调pH至8.0，定容至500mL，高压灭菌。

B.2.30.5mol/L盐酸溶液

量取25mL浓盐酸，加水定容至500mL。

B.2.4CTAB提取液

称取81.7g氯化钠和20gCTAB溶于适量水中，加入1mol/LTris-HCl100mL，0.5mol/LEDTA40

mL，定容至1000mL，4℃贮存。

B.2.5TE缓冲液

量取1mol/LTris-HCl5mL，0.5mol/LEDTA1mL，加盐酸调pH至8.0，定容至500mL。

B.2.65mol/L氯化钠溶液

称取146g固体氯化钠溶于水中，定容至500mL。

B.3PCR扩增溶液的配制

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B.3.1dNTP

量取超纯水分别配制dATP、dTTP、dCTP、dGPT终浓度100mmol/L的储存液，各取20μL混合，加

超纯水720μL定容至每种终浓度2.5mmol/L工作液。

B.3.2SSR引物

量取超纯水分别配制上游引物和下游引物终浓度均40μmol/L的储存液，等体积混合成20μmol/L工

作液。

注：干粉配制前应首先快速离心。

B.3.36倍加样缓冲液

量取去离子甲酰胺49mL，0.5mol/L的EDTA溶液（pH8.0）1mL，加溴酚兰0.125g，二甲苯青0.125

g。

B.4变性聚丙烯酰胺凝胶电泳溶液的配制

B.4.140％PAGE胶

称取丙烯酰胺190g和甲叉双丙烯酰胺10g，定容至500mL。

B.4.24.5%PAGE胶

称取尿素450g，量取10倍TBE缓冲液100mL，40%PAGE胶112.5mL，定容至1000mL。

B.4.3Bind缓冲液

量取49.75mL无水乙醇，250μL冰醋酸，混匀。

B.4.4亲和硅烷工作液

量取1mLBind缓冲液，加入5μLBind原液，混匀。

B.4.5剥离硅烷工作液

2%二甲基二氯硅烷。

B.4.625%过硫酸铵溶液

称取0.25g过硫酸铵溶于1mL超纯水。

B.4.710倍TBE缓冲液

称取Tris碱108g，硼酸55g，量取0.5mol/LEDTA溶液37mL，定容至1000mL。

B.4.81倍TBE缓冲液

量取10倍TBE缓冲液500mL，加水定容至5000mL。

B.5银染溶液的配制

B.5.1固定液

量取100mL冰醋酸，加水定容至1000mL。

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B.5.2染色液

称取2g硝酸银，加水定容至1000mL。

B.5.3显影液

1000mL蒸馏水中加入30g氢氧化钠和5mL甲醛。

C

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附录C

（规范性附录）

核心引物名单及序列表

表C.1规定了核心引物名称及序列。

表C.1核心引物名单及序列表

编号引物名称引物序列

上游：GGTAACCAACCAGCGCATTGC

P01MI32

下游：GCGTTCTCGAACTTGCACTCTC

上游：GCGGCGGGAATGGTTGATG

P02MI34

下游：GAAGCCGTGGCACCAAAGC

上游：AGCTGCAACCTGTCTTGAGAGC

P03MI35

下游：GCAGAAGTGGCCGCGACAG

上游：TCCTCCTACACGGGCAGACC

P04MI28

下游：AGCTCGGGGCAGCGATAAAC

上游：CAGGCTCTGCCGAGGAACG

P05MI40

下游：CACGCGGTGGCAAAAGAACTC

上游：GCAAGTCGGATGCGATAGCC

P06MI50

下游：CGTGGGTGGGCATCTATGATCG

上游：GAACGCTGAACCCTACCCTCTC

P07MI36

下游：AGGTCTGGGCTACGGGCTAC

上游：CTCGCGTATATGGCTCCAAGTG

P08MI10

下游：GAGTCGCCGTCGCATGGTC

上游：AACGCCAACTCACCAACACAAG

P09MI47

下游：AGGAGCAAGACGTGGAGCATG

上游：CGACTGGGTCTCTAGCCACCAC

P10MI54

下游：CCTTGCCACCCTTCGGACTAAC

上游：TCGGATGGGCAGACGAGAGG

P11MI03

下游：CACACACCGCCAAGGCAAAG

上游：GCTCAGCGCCCAGTTCGAC

P12MI02

下游：AAAGAAGAGCGGTTTGCGTGAC

上游：AAGAAGAGCGGAGTAGCTTGCG

P13MI63

下游：TCAGACACACTGGGCCTAATGC

上游：TTCCTGCCGCGCTTTCTCG

P14MI37

下游：CGGAGAATTACTGCCCGAGGAG

上游：CCTGCCCTCTGTCCCTGTATTC

P15MI31

下游：TTTAGGAGGCGGCATTTTGGTG

上游：ACAACGCATGGACTGTGATCG

P16MI27

下游：TGTTGTACTGCAACGCCGAAAG

上游：CCGTCGTGGGAAGCAGTGC

P17MI18

下游：AGACTCGGTTTCGCCAATTTGC

上游：ACTGGACTGTAAGCACAAGTGC

P18MI61

下游：CTTTGACAGTTCAGGCGGGTTG

上游：GCCGCGCAAACCCCTAAAC

P19MI12

下游：CGGGGAAGTCGAGCACCTC

上游：CGAAAGCACAGGTACCCTTGTC

P20MI44

下游：CAGCCCCTCCGTCTTTGCC

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DB1307/T300—2020

表C.1核心引物名单及序列表（续）

编号引物名称引物序列

上游：GCGCAACATAGTCCCGAAAATG

P21MI38

下游：TACCTGGACATCCCTGCTCTCG

上游：GGTGGGCGGAATCCTGATGAAC

P22MI06

下游：TTCACCCCGGCATAAGTTCAGG

上游：CGGCAAGCGTGGTGTCCTAG

P23MI59

下游：ACTCTGGCGAGGAAAGGATGC

上游：CACTGCGAGTATTGCGTGTGC

P24MI14

下游：TTGCTCATGGAAACGGTCACTG

上游：CGATCATCCCGTTCCTTGCATG

P25MI25

下游：CAAGAGCCCAGAGGTCCTGTAC

上游：AACCAATGCGGCTGCAAACG

P26MI20

下游：TTGGGTTCGGTCCGCTCATTC

上游：TCGCCCCGTCCATTTCGTG

P27MI62

下游：CGAATTCCTGCGAGCTGACATG

上游：GGTGTGCTGGTGAACGCATAGG

P28MI07

下游：TCGGTCGCGTGTTGGCTTG

上游：GCTGTCATGTCGATCTGATGGC

P29MI19

下游：GGCCAATTGCGATTCGTCCAG

上游：CCACTCTGCAACCCACTCTCC

P30MI41

下游：CCAGAATGGGCCGCTCACC

上游：ACGTCAAGGCTTCCGTCTGTC

P31MI42

下游：CCGCCACAGCGCGTTAATTAG

上游：TCAGAGCCCGAATCATCGCTAC

P32MI04

下游：ACTCTAGGGAGGGAGCCTTCTC

上游：GTTTGCCGGTATGTGACGTTGC

P33