DB44/T 665-2009 蛋中喹诺酮类药物的多残留检测方法

ICS67.050

B04

备案号：25947-2009DB44

广东省地方标准

DB44/T665—2009

蛋中喹诺酮类药物的多残留检测方法

Multiresiduedeterminationofquinoloneantibioticsinegg

2009-08-06发布2009-12-01实施

广东省质量技术监督局发布

DB44/T665—2009

前言

本标准附录A和附录B为资料性附录。

本标准由广东省农业厅提出并归口。

本标准起草单位：国家兽药残留基准实验室（华南农业大学）。

本标准主要起草人：黄显会、曾振灵、杨桂香、饶勇、董爱国、刘志昌、陈杖榴。

本标准为国内首次发布的广东省地方标准。

I

DB44/T665—2009

蛋中喹诺酮类药物的多残留检测方法

1范围

本标准规定了鸡蛋中喹诺酮类药物残留检测的高效液相色谱（HPLC）和液相色谱－串联质谱

(LC-MS-MS)测定方法，规定LC-MS-MS法为仲裁法。

本标准适用于鸡蛋中恩诺沙星、环丙沙星、达氟沙星、沙拉沙星、二氟沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、

培氟沙星、洛美沙星、氟甲喹和噁喹酸单个或多个药物的残留的HPLC法定量测定。本标准还适用于鸡蛋

中恩诺沙星、环丙沙星、达氟沙星、沙拉沙星、二氟沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、培氟沙星、洛美沙星、

麻保沙星、氟甲喹、萘啶酸和噁喹酸单个或多个药物残留的LC-MS-MS法定量测定和确证。

2规范性引用文件

下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的

修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究

是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。

GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法

3试样的制备与保存

3.1试样的制备

取新鲜或冷藏的鸡蛋3～5枚，去蛋壳，以10000r/min匀浆5min，装入洁净的容器中，密封。

空白鸡蛋，作为空白试样；添加适宜浓度的标准溶液的空白鸡蛋，作为空白加标试样；供试样品，

作为供试试样。

3.2试样的保存

试样应在-20℃以下保存。

4HPLC法

4.1原理

鸡蛋样品中喹诺酮类药物以乙腈-三氯乙酸提取，反相聚合物SPE柱净化。以柠檬酸乙酸铵-乙腈为

流动相，梯度洗脱程序波长高效液相-荧光法测定，外标法定量。

4.2试剂

以下所有试剂，除特别注明者外均为分析纯试剂；水为符合GB/T6682规定的一级水。

4.2.1乙腈：色谱纯。

4.2.2甲醇：色谱纯。

4.2.3柠檬酸。

4.2.4乙酸铵。

4.2.5三乙胺。

4.2.6磷酸氢二钠。

4.2.7磷酸二氢钠。

4.2.8乙酸。

4.2.9氢氧化钠。

4.2.10三氯乙酸。

1

DB44/T665—2009

4.2.11乙酸溶液：10%

取10mL，用水稀释定容至100mL。

4.2.12氢氧化钠溶液：0.5mol/L

称取氢氧化钠2.0g，用水溶解，稀释定容至100mL。

4.2.13三氯乙酸溶液：10%

称取三氯乙酸100g溶于1000mL水中。

4.2.14乙腈-10%三氯乙酸溶液(20＋80，V/V)。

4.2.15磷酸盐缓冲液：0.05mol/L（pH7.4）。

称取NaH2PO42H2O7.25g和Na2HPO412H2O0.74g，用水溶解，稀释定容至1L。

4.2.16甲醇水溶液：10%（V/V）。

4.2.17柠檬酸/乙酸铵缓冲液

称取柠檬酸10.56g和乙酸铵7.87g，用水溶解，稀释定容至1L，加三乙胺约1mL调pH至4.0，

0.45μm滤膜抽滤。

4.2.18乙腈－柠檬酸/乙酸铵缓冲液（8＋92，V/V）。

4.2.19喹诺酮类药物对照品：恩诺沙星、环丙沙星、达氟沙星、沙拉沙星、二氟沙星、诺氟沙星、氧

氟沙星、培氟沙星、洛美沙星、氟甲喹和噁喹酸，各药物纯度均大于98.0%

4.2.2011种喹诺酮类药物标准储备液

4.2.20.1诺氟沙星、氧氟沙星、恩诺沙星、沙拉沙星和二氟沙星标准储备液：1.0mg/mL。

取上述药物的对照品，准确称定，用乙酸溶液200L溶解，用甲醇稀释定容至10.0mL，分别制成

1.0mg/mL的喹诺酮类药物标准贮备溶液。

4.2.20.2环丙沙星、洛美沙星、培氟沙星和达氟沙星标准储备液：1.0mg/mL。

取盐酸环丙沙星、盐酸洛美沙星、甲磺酸培氟沙星和甲磺酸达氟沙星的对照品，准确称定，用水200

L溶解，用甲醇稀释定容至10.0mL，分别制成1.0mg/mL的喹诺酮类药物标准贮备溶液。

4.2.20.3噁喹酸和氟甲喹标准储备液：1.0mg/mL。

取上述药物的对照品，准确称定，用氢氧化钠溶液400L溶解，用甲醇稀释定容至10mL，分别制

成1.0mg/mL的喹诺酮类药物标准贮备溶液。

4.2.2111种喹诺酮类药物混合标准中间溶液：此混合标准中间溶液中含诺氟沙星、环丙沙星、氧氟

沙星、培氟沙星、洛美沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、二氟沙星、氟甲喹和噁喹酸的浓度为8g/mL，含

达氟沙星的浓度为3.2g/mL。分别准确量取适量的每种喹诺酮类药物标准贮备溶液，用甲醇稀释成上

述含量的11种喹诺酮类药物混合标准中间溶液。

4.3仪器设备

4.3.1高效液相色谱仪：配荧光检测器，可以进行二元梯度洗脱。

4.3.2分析天平：感量0.0001g。

4.3.3电子天平：感量0.01g。

4.3.4组织匀浆机。

4.3.5旋涡混合仪。

4.3.6超声波水浴。

4.3.7高速冷冻离心机，配1.5mL、15mL转头。

4.3.8氮气吹干浓缩仪。

4.3.9可调微量移液器：10～100L、20～200L、100～1000L、500～5000L。

4.3.10负压固相萃取装置：配备真空泵。

4.3.11反相聚合物SPE柱：Strata-X填料，60mg/3mL，或相当者。

4.3.12保护柱：C18。

4.4测定步骤

2

DB44/T665—2009

4.4.1提取

取试样，室温解冻，称取（2.0±0.02）g，置匀浆杯中，加磷酸盐缓冲液4.0mL，旋涡混合30s。加

乙腈-10%三氯乙酸溶液10mL，以10000r/min匀浆3min，转移至50mL离心管中；另用乙腈-10%三氯乙

酸溶液5mL洗刀头和匀浆杯，合并样液，旋涡混合30s；超声5min；在4℃条件下，以8000r/min离心6min；

取全部上清液置试管中，用磷酸盐缓冲液10mL稀释后备用。

4.4.2SPE净化

将反相聚合物SPE柱以3mL甲醇活化,3mL水平衡；加入上述用磷酸盐缓冲液稀释后的提取液，保

持流速约为1mL/min；甲醇水溶液3mL淋洗，抽干；甲醇3mL洗脱，抽干。洗脱液于60～70℃氮气吹

干，用乙腈－柠檬酸/乙酸铵缓冲液1000μL溶解残留物，涡旋混匀，在4℃条件下，12000r/min离心6min，

上清液转移至样品瓶中供高效液相色谱仪测定。

4.4.3标准曲线的制备

称取(2.0±0.01)g空白鸡蛋试样，加11种喹诺酮类药物系列混合标准中间溶液适量，制得的空白加标

试样含达氟沙星的量为5.0、10.0、20.0、40.0、80.0、016g/kg，含其他喹诺酮类药物为12.5、25.0、50.0、

100.0、200.0、400.0g/kg。按4.4.1进行样品提取和4.4.2净化和按4.4.4条件进行HPLC测定。将样品的色

谱峰面积和相对应的药物质量浓度进行线性回归，得到各个药物的校正标准曲线。

4.4.4测定

4.4.4.1色谱条件

色谱柱：C18（250mm×4.6mm，粒径5m）。或其他效果等同的C18柱。

保护柱：C18（4.0mm×3.0mm）。或其他效果等同的C18柱。

流动相：乙腈+柠檬酸/乙酸铵缓冲液，梯度洗脱见表1。

柱温：50℃。

进样量：40L。

荧光检测器：程序波长变化设置见表2。波长变换的时间在二氟沙星完全出峰之后和噁喹酸尚未出

峰之前的保留时间，若分离系统的保留时间发生了改变，则此时间参数也要进行相应的调整，本标准所

提供的波长变换时间仅供参考。

表1梯度洗脱流动相变化设置

时间(min)流量(mL/min)乙腈，%柠檬酸/乙酸铵缓冲液，%曲线

02.09916

11.002.09916

20.002.029716

25.002.035456

26.002.09916

30.002.09916

表2荧光程序波长变化设置

时间(min)激发波长Ex(nm)发射波长Em(nm)

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