T/CRHA 017-2023 人肝祖细胞类器官构建、质量控制与保藏操作指南

ICS11.100

CCSC04

团体标准

T/CRHA017—2023

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人肝祖细胞类器官构建、质量控制与保藏

操作指南

Guidelinesfortheestablishment，qualitycontrolandstorage

ofHumanhepaticprogenitorcellderivedorganoids

2023-07-14发布2023-08-01实施

中国研究型医院学会发布

T/CRHA017—2023

目次

前言...................................................................................................................................................II

引言.................................................................................................................................................III

1范围...............................................................................................................................................1

2规范性引用文件...........................................................................................................................1

3术语和定义...................................................................................................................................1

4缩略语...........................................................................................................................................3

5基本原则.......................................................................................................................................3

6操作流程与方法...........................................................................................................................4

7检测指标与检测方法...................................................................................................................7

附录A（资料性）肝脏类器官培养用主要试剂材料与操作要点.................................................9

附录B（资料性）短串联重复序列（STR）检测.........................................................................11

附录C（资料性）染色体核型检测...............................................................................................12

附录D（资料性）肝脏类器官鉴定...............................................................................................13

附录E（资料性）标志基因检测实时荧光定量PCR法.............................................................17

参考文献...........................................................................................................................................19

I

T/CRHA017—2023

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第一部分：标准化文件的结构和起草规则》给出的规

则起草。

本文件由中国研究型医院学会肝胆胰外科专业委员会提出。

本文件由中国研究型医院学会归口。

本文件起草单位：清华大学附属北京清华长庚医院、中国食品药品检定研究院、中国计量科学研究

院、中国医学科学院药物研究所、中国科学院上海药物研究所、上海美迪西生物医药股份有限公司。

本文件主要起草人：王韫芳、李迪、刁金美、陈昱安、王璇、耿兴超、王晶、傅博强、强桂芬、潘

国宇、彭双清、李桦。

II

T/CRHA017—2023

引言

类器官（organoids）是具有器官关键性特征的三维（3D）细胞培养物，它包括一个自

我更新干细胞群，可分化为多个器官特异性的细胞类型，与相对应的器官拥有类似的空间组

织并能够重现对应器官的部分功能，从而提供一个高度生理相关系统。类器官与传统模型相

比，具备细胞增殖分化、自我更新、自组装、可长期培养、遗传稳定性等特点，因此可以模

拟体内器官发育和生理过程，是一种可用来开发模拟人类疾病的更好模型，和高效、低成本、

精准的药筛平台。

作为近10年来生物学界和临床医学最热门的前沿技术之一，类器官技术取得突飞猛进

的发展，人体各个器官均有其类器官建立的报道，同样肝脏类器官的建立及应用也是研究的

热点。肝脏类器官培养起始细胞来源较多，包括多能干细胞、原代分离的肝（祖）细胞等，

而人肝脏组织的来源可能涉及的风险和伦理敏感性，运送的冷链保持，类器官建立所涉及的

原代细胞分离、培养、扩增、冻存、复苏、质量控制、功能分析检测等具体试验操作的标准

规范，以及整个过程中的污染控制，都体现了肝脏类器官建立及检测方案的多样性、复杂性

和特殊性。

鉴于此，制定实验室人肝祖细胞类器官的构建、保藏及检测应遵循的技术通用要求，有

助于规范人肝脏类器官的研究、开发与评价，从而推动肝脏类器官在基础医学和临床研究(包

括肝脏发育学的研究、疾病模型的建立、药物的筛选、基因治疗和器官芯片的研发等)应用

中的发展。

III

T/CRHA017—2023

人肝祖细胞类器官构建、质量控制与保藏操作指南

1范围

本文件提供了人肝祖细胞类器官构建、质量控制和保藏的基本原则、操作流程方法以及检测指标与

检测方法的指导与建议。

本文件适用于人肝祖细胞类器官的培养、传代、储存、复苏和质量控制。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB/T37864—2019生物样本库质量和能力通用要求（ISO20387:2018）

GB/T38736—2020人类生物样本保藏伦理要求

GB/T42060—2022医学实验室样品采集、运送、接收和处理指南（ISO/TS20658:2017）

WS233—2017病原微生物实验室生物安全通用准则

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

类器官organoids

类器官是干细胞、前体细胞和/或分化细胞通过细胞-细胞间以及细胞-基质间的互作而自发组织形成

的体外三维结构，能在多个方面再现体内相应组织或器官的结构与功能。

3.2

肝祖细胞liverprogenitorcells

一种卵圆形、高核质比的细胞，位于肝实质细胞与汇管区交界的Hering’s管，从形态和体积上类似

于胆管上皮细胞，被认为具有肝细胞、胆管细胞双向分化潜能。

3.3

3D细胞培养three-dimensionalcellculture

将具有三维结构不同材料的载体与各种不同种类的细胞在体外共同培养,使细胞能够在载体的三

维立体空间结构中迁移、生长,构成三维的细胞-载体复合物。

1

T/CRHA017—2023

3.4

肝脏类器官培养基culturemediumofliverorganoids

用于提供体外模拟肝祖细胞生长及分化所需微环境，能诱导肝脏祖细胞长期体外扩增培养，并向成

熟肝细胞分化，维持肝祖细胞及肝脏细胞特性，实现体外肝脏活组织类器官长期存活的培养介质。

3.5

3D培养基质胶matrix

组成成分包括但不限于层粘连蛋白、Ⅳ型胶原、巢蛋白、硫酸肝素糖蛋白，添加物包括但不限于

生长因子、小分子化合物和/或微量元素激素。在室温条件下能够聚合形成具有生物学活性的三维基质，

模拟体内细胞基底膜结构和功能，能够为肝脏上皮细胞的生长提供支架。

3.6

类器官传代passage

将培养至一定大小、状态良好的类器官采用物理机械吹打或联合酶消化方法使其解离为小细胞团或

单细胞悬液，再重新接种于与原培养条件相同的培养体系内，继续进行类器官培养。新一代类器官与原

来类器官具有相同的形态功能特征。

3.7

类器官冻存cryopreservation

将类器官解离成小细胞团或单细胞悬液后，加入冻存保护剂，通过程序降温最终置于-196℃液氮中

低温保存，使其暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，在需要的时候能够通过复苏用于试验的过

程。

3.8

类器官复苏thawing

将处于深低温冻存的类器官取出恢复其继续生长状态的过程。

3.9

肝脏祖细胞分化differentiation

肝脏祖细胞逐渐产出形态结构、基因表达、功能特征成熟肝细胞的过程。

3.10

知情同意informedconsent

2

T/CRHA017—2023

有自主判断能力的供体或其法定监护人，在获得并充分了解样本和数据捐赠相关信息之后，供体所

受到的风险最小，且没有受到任何利诱或恐吓等不当行为影响的前提下，自愿自主的捐赠个人生物样本

及其关联数据，并与采集者/收集者共同签署的文件。

注：知情同意书由采集者/收集者和被收集者共同签署，一式两份。正本由采集者/收集者保存，被

收集者保存副本。

[来源：GB/T38736—2020]

3.11

类器官存活率organoidsviability

类器官保持活性的属性（例如，新陈代谢活跃，具有增殖能力，有完整的三维结构，或有能力恢复

这些功能）。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

ALB——白蛋白（albumin）

CYP3A4——细胞色素蛋白P450酶3A4（CytochromeP4503A4）

DMSO——二甲基亚砜（DimethylSulfoxide）

DNA——脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleicacid）

EpCAM——上皮细胞黏附蛋白（Epithelialcelladhesionmolecule）

H&E——苏木精-伊红（Hematoxylinandeosin）

HNF4α——肝细胞核因子同源框蛋白α（HNF4homeoboxα）

LGR5——亮氨酸重复序列G蛋白偶联受体5（LeucinerepeatGprotein-coupledreceptor5）

Ki67——细胞增殖蛋白

PBS——磷酸盐缓冲液（PhosphateBufferSaline）

SOX9——SRY基因（性别决定区域Y）9（SRY(sexdeterminingregionY)-box9）

STR——短串联重复序列（shorttandemrepeat）

ZO-1——紧密连接蛋白1（zonulaoccluden1）

5基本原则

5.1签署知情同意

应在样本采集前获得类器官细胞源供者的书面的知情同意，明确供者和样本收集方双方的利益和责

任，知情同意的要求应符合GB/T38736—2020中5.3的要求。

3

T/CRHA017—2023

5.2伦理要求

人肝祖细胞类器官的构建和研究方案应由伦理审查委员会审查通过。

5.3隐私保护

类器官细胞源供者享有个人隐私权，其个人隐私信息的保密和保护应符合GB/T38736—2020中6的

要求。

6操作流程与方法

6.1肝祖细胞类器官构建

6.1.1组织的获取

肝移植供体肝脏组织，体积约5mm×5mm×5mm。新鲜组织应在离体30min内切取。

6.1.2组织的运送

手术获取的肝脏组织置于4℃保存的组织保存液（含2×双抗的1640培养基），在4℃恒温的低温条

件下运送至实验室。对运输过程的记录符合GB/T37864—2019中A.3、B.3条，宜记录的内容包括但不限

于运送方式、运送过程中的温度，接收时温度或温度范围、运送起止时间和日期。

6.1.3组织的处理

6.1.3.1组织的清洗

在超净台中将肝脏组织取出，用预冷的含1×双抗的PBS缓冲液震荡漂洗3次（超净台内手动摇晃培

养皿10s）。

6.1.3.2组织的消化

用手术刀片将漂洗后的肝脏组织机械解离成1mm3大小的组织块，加入消化酶（含1mg/mL的IV型

胶原酶、30,000units/mL的DNaseI的混合液）37℃消化30min，用预冷PBS缓冲液离心漂洗2次（1000r/min,

3min）终止消化。

6.1.3.3细胞的过滤

离心后的细胞沉淀用1640培养基重悬后用70μm的筛网去除胞外基质杂质。

6.1.4类器官培养

采用机械