SF/T 0134-2023 法医学生物检材核酸提取技术规范

ICS07.140

CCSC06

SF

中华人民共和国司法行政行业标准

SF/T0134—2023

法医学生物检材核酸提取技术规范

Technicalspecificationfornucleicacidextractionofforensicbiologicalsample

2023-10-07发布2023-12-01实施

中华人民共和国司法部发布

SF/T0134—2023

目次

前言.................................................................................II

1范围...............................................................................1

2规范性引用文件.....................................................................1

3术语和定义.........................................................................1

4缩略语.............................................................................1

5总体要求...........................................................................2

6常用仪器和设备.....................................................................2

7常用试剂推荐配方...................................................................2

8DNA提取与纯化......................................................................2

9RNA提取与纯化......................................................................8

10核酸质量评估.....................................................................12

11样品保存与记录...................................................................13

附录A（资料性）常用试剂推荐配方....................................................14

附录B（规范性）RNA提取注意事项....................................................15

参考文献.............................................................................16

I

SF/T0134—2023

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由司法鉴定科学研究院提出。

本文件由司法部信息中心归口。

本文件起草单位：司法鉴定科学研究院、复旦大学。

本文件主要起草人：李成涛、张素华、陶瑞旸、陈安琪、林源。

II

SF/T0134—2023

法医学生物检材核酸提取技术规范

1范围

本文件规定了法医学常见生物检材的核酸提取方法和质量评估方法。

本文件适用于实验室对生物检材进行核酸的提取、纯化以及质量评估。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T27025检测和校准实验室能力的通用要求

JJG646移液器检定规程

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

核酸nucleicacid

由核苷酸或脱氧核苷酸通过3,5-磷酸二酯键连接而成的一类生物大分子。

注：包括脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）两类，是储存遗传信息和传递遗传信息的主要物质。

核酸完整度integrityofnucleicacid

核酸（3.1）提取过程中一级结构（序列）保持完整而不发生改变的程度。

核酸纯度purityofnucleicacid

核酸（3.1）提取物中目标核酸与残留杂质的相对含量。

注：残留杂质包括来自于检材的蛋白质、多酚、多糖等，来自于提取溶剂的有机物、异硫氰酸盐等，以及DNA提取时

残留的RNA、RNA提取时残留的DNA。

提取产量extractionyield

单位样品中提取到的核酸的总质量。

注：用于评估提取效率。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（CetyltrimethylammoniumBromide）

DNA：脱氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid）

DTT：二硫苏糖醇（Dithiothreitol）

EDTA：乙二胺四乙酸（EthylenediaminetetraaceticAcid）

OD：光密度（OpticalDensity）

PBS：磷酸缓冲盐溶液（PhosphateBufferedSaline）

PCR：聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction）

PVP：聚乙烯基吡咯烷酮（Polyvinylpyrrolidone）

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SF/T0134—2023

PVPP：交联聚乙烯基吡咯烷酮（Polyvinylpolypyrrolidonecross-linked）

RIN：RNA完整值（RNAIntegrityNumber）

RNA：核糖核酸（RibonucleicAcid）

RNase：核糖核酸酶（Ribonuclease）

SDS：十二烷基磺酸钠（SodiumDodecylSulfonate）

TE：含乙二胺四乙酸的三羟甲基氨基甲烷缓冲液（Tris-EDTABufferSolution）

Tris：三（羟甲基）氨基甲烷（TrisHydroxymethylaminomethane）

5总体要求

本文件中法医学生物检材包括人源性生物检材及非人源性生物检材，有条件的情况下，宜选择新

鲜的检材。

本文件中核酸提取包括DNA提取和RNA提取。

核酸提取过程中宜避免物理因素（如剪切力、高温等）、化学因素（如强酸、强碱等）和生物因

素（如核酸酶等）的破坏，保证一级结构的完整性。提取过程中宜避免外界环境（如灰尘、气溶胶等）

对核酸提取的污染；排除其他分子（如蛋白质、多糖、脂类和有机溶剂等）的污染；以及防止试验过程

中废弃物和废弃液等对环境的污染。在整个试验过程中应采取安全有效的防护措施。

核酸提取宜使用商品化试剂，具体操作流程宜参照商品化试剂的使用说明书。无商品化试剂或相

应的使用说明书时，应按照第8章和第9章的规定执行。具体操作应根据样本量、样本状态等调整实验

试剂的用量、离心参数等，并制定相应方法的作业指导书。

核酸提取可采用全自动核酸提取工作站，具体步骤参照工作站的操作说明书进行。

核酸提取过程中所使用的水均为符合GB/T6682规定的一级水。除非另有规定，所采用试剂均为

分析纯级别，所有试剂溶液宜大体积配制、小体积分装后使用，酶溶液应避免反复冻融。

实验室的环境和设施应符合GB/T27025的规定。为了有效防止核酸污染，实验室宜根据预处理步

骤设置不同的工作区域，所有实验操作宜在规定的区域进行。

6常用仪器和设备

常用仪器和设备宜包括：

a)冷冻研磨机；

b)冷冻离心机；

c)涡旋振荡仪；

d)平板电泳仪；

e)磁力架；

f)水浴锅或干式恒温金属浴；

g)凝胶成像系统（像素不小于130万）；

h)可调移液器（符合JJG646的规定）；

i)紫外分光光度仪（波长范围：190nm～1100nm；波长准确度与重复性：±0.1nm）；

j)精密天平（精度为0.1mg）；

k)荧光定量仪（灵敏度应达到10pg/μL）；

l)荧光定量PCR仪。

7常用试剂推荐配方

核酸提取中常用试剂推荐配方见附录A。

8DNA提取与纯化

聚苯乙烯二乙烯基苯树脂法（Chelex提取法）

8.1.1原理

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Chelex-100是一种由苯乙烯、二乙烯基苯共聚体组成的化学螯合树脂，含有成对的亚氨基二乙酸

离子，可螯合多价金属离子。在低离子强度、碱性和煮沸条件下，Chelex-100通过螯合金属离子去除非

核酸杂质并抑制DNA降解，经离心后上清液中的DNA可用于后续检测。

提取过程在单管内进行，不涉及转移，可有效减少污染和损失，但提取的DNA纯度不高，适用于普

通PCR反应模板制备，不适用于高通量测序的模板制备。

8.1.2试剂

试验过程中主要采用的试剂如下：

a)Chelex-100溶液；

b)蛋白酶K；

c)DTT；

d)SDS。

8.1.3方法

8.1.3.1血液（斑）

采用Chelex提取法对血液（斑）进行DNA提取的主要步骤如下：

a)取适量血液（斑）检材至1.5mL离心管中并加入适量纯水，振荡充分混匀，室温放置30min

以上；

b)高速离心后去上清液，沉淀中加入5%Chelex-100溶液，振荡后56℃孵育30min以上；

c)高速振荡；煮沸或干浴100℃，保温8min，振荡，高速离心；吸取上清液DNA，冷藏或冷冻

保存。

8.1.3.2唾液（斑）

采用Chelex提取法对唾液（斑）进行DNA提取的主要步骤如下：

a)取适量唾液（斑）检材至1.5mL离心管中并加入适量纯水，振荡充分混匀，室温放置30min

以上；

b)高速离心后去上清液，沉淀中加入5%Chelex-100溶液，振荡后56℃孵育1h以上；

c)高速振荡；煮沸或干浴100℃，保温8min，振荡，高速离心；吸取上清液DNA，冷藏或冷冻

保存。

8.1.3.3精液（斑）

采用Chelex提取法对精液（斑）进行DNA提取的主要步骤如下：

a)取适量精液斑检材至1.5mL离心管中并加入适量纯水，振荡充分混匀，室温放置0.5h～1

h；

b)高速振荡1min，如有载体，可选择套管离心去除；

c)高速离心2min，保留少许上清，吹打沉淀。宜取适量悬浮液经染色后进行镜检，如未检出上

皮细胞，从步骤d）开始；如检出上皮细胞，应按照差异提取法根据精子和上皮细胞的大致比

例对消化的时间、温度和试剂浓度进行调整。差异提取法中第1步消化后的上清液中含有上皮

细胞DNA，对于高速离心得到的沉淀，宜用纯水离心漂洗3次及以上；第2步消化液中含有精

子细胞DNA；

d)加入适量Chelex-100溶液、蛋白酶K和DTT，充分振荡，56℃孵育1h以上；

注：精液提取直接从d）步骤开始。

e)高速振荡；煮沸或干浴100℃，保温8min，振荡，高速离心；吸取上清液DNA，冷藏或冷冻

保存。

8.1.3.4毛发

采用Chelex提取法对毛发进行DNA提取的主要步骤如下。

a)按照不同检材部位采取不同的处理方法。

1)毛根：剪取1cm左右含毛囊的毛发，剪碎后放入1.5mL离心管中，加入Chelex-100溶

液和蛋白酶K，56℃孵育5h～6h或者过夜；

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2)毛干：剪取适量毛干，使用无水乙醇、纯水和无水乙醇依次冲洗，晾干后剪碎，放入1.5

mL离心管中，加入Chelex-100溶液、蛋白酶K和DTT，56℃孵育至完全溶解。

b)高速振荡；煮沸或干浴100℃，保温8min，振荡，高速离心；吸取上清液DNA，冷藏或冷冻

保存。

8.1.3.5软组织

采用Chelex提取法对软组织进行DNA提取的主要步骤如下：

a)取少量软组织用纯水冲洗，剪碎后放入1.5mL离心管中；

b)加入Chelex-100溶液和蛋白酶K，56℃孵育至完全消化；

c)高速振荡；煮沸或干浴100℃，保温8min，振荡，高速离心；吸取上清液DNA，冷藏或冷冻

保存。

有机溶剂提取法（苯酚-氯仿提取法）

8.2.1原理

在碱性环境和螯合剂EDTA作用下溶解细胞膜和核膜，利用阴离子去污剂SDS和蛋白酶K消化核蛋

白，利用苯酚和氯仿有机溶剂萃取DNA，除去蛋白酶、去污剂和残留蛋白，最后利用无水乙醇沉淀DNA，

去除残留的氯仿，得到纯净的DNA。这一方法能从检材中提取到分子量相对较大的DNA，且DNA纯度较

高。

8.2.2试剂

试验过程中主要采用的试剂如下：

a)细胞裂解缓冲液（含有螯合剂EDTA）；

b)蛋白酶K；

c)DTT；

d)TNE缓冲液；

e)TES裂解液；

f)0.5mol/LEDTA（pH10.0）；

g)无水乙醇（−