DB63/T 1159-2012 甘蓝型杂交油菜品种纯度检验 ISSR操作规程

ICS65.020.20

B33

备案号：35826-2013DB63

青海省地方标准

DB63/T1159—2012

甘蓝型杂交油菜品种纯度检验ISSR操作规程

2012-12-04发布2013-01-01实施

青海省质量技术监督局发布

DB63/T1159—2012

前言

本规程按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。

本规程由中国科学院西北高原生物研究所提出并归口。

本规程起草单位:中国科学院西北高原生物研究所、青海省种子管理站。

本规程主要起草人：李毅、胡延萍、宋晓荭、彭秉玉、王莉、王焕强、巩爱岐、包天忠、王溪、冯

承彬。

I

DB63/T1159—2012

甘蓝型杂交油菜品种纯度检验ISSR操作规程

1范围

本规程规定了甘蓝型杂交油菜（BrassicanapusL.和BrassicacampestrisL.）品种纯度ISSR

指纹鉴定的术语和定义、设备与耗材、试剂及溶液的配制、操作程序、判定原则及报告等技术内容。

本规程适用于各级科研、推广、生产单位和种子部门等在甘蓝型杂交油菜品种纯度检验时使用。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T3543.1农作物种子检验规程总则

GB/T3543.2农作物种子检验规程扦样

GB/T3543.4农作物种子检验规程发芽试验

GB/T3543.5农作物种子检验规程真实性和品种纯度鉴定

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求

3术语和定义

下列术语和定义适用于本规程。

3.1

聚合酶链式反应（以下简称PCR）

一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。

3.2

引物

一条互补结合在模板DNA链上的短的单链，在3′-OH端作为DNA合成的起点，延伸合成模板DNA的互补

链。

3.3

简单重复序列区间（以下简称ISSR）

根据某个简单重复序列（微卫星位点）作为特异引物，通过PCR反应扩增模板DNA链上微卫星位点

间隔的碱基序列。

4设备与耗材

1

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4.1设备

——高速低温离心机；

——PCR扩增仪；

——多用电泳仪及水平式电泳槽；

——紫外凝胶成像系统；

——微量移液器：规格为0.2L-2L，1L-10L，2L-20L，5L-50L，20L-200L，200L-1000L；

——电子分析天平；

——磁力加热搅拌器；

——蒸汽压力灭菌锅；

——恒温水浴锅；

——微波炉。

4.2耗材

——离心管：0.2mL，1.5mL，2.0mL；

——研钵；

——移液器吸头：20L，200L和1000L；

——烧杯；

——三角烧瓶；

——PE手套：一次性聚乙烯手套。

5试剂及溶液的配制

5.1试剂要求

试剂需使用分析纯级。配制试剂所使用的水，除另有说明外，使用按GB/T6682规定的一级水。

5.2试剂

——CTAB:十六烷基三甲基溴化胺；

——β-巯基乙醇；

——Tris：三羟甲基氨基甲烷；

——PVP：聚乙烯吡咯烷酮碘络合物；

——TaqE：DNA聚合酶，附带6倍loadingbuffer、10倍buffer和25.0mmol/LMgCl2；

——dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸；

——λDNA/HindШmarker

——100bp或200bpDNAmarker；

——EB：溴化乙锭

——10倍buffer：10倍反应缓冲液；

——氯化镁；

——6倍loadingbuffer：6倍上样缓冲液；

——Primer：引物；

——EDTANa22H20：乙二胺四乙酸二钠；

——ddH2O：经高压灭菌的二次蒸馏水；

——氯化钠；

2

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——氢氧化钠；

——无水乙醇；

——氯仿；

——异戊醇；

——异丙醇；

——盐酸；

——醋酸；

——石英砂；

——琼脂糖。

5.3溶液的配制

见附录A。

6操作程序

6.1植物样品准备

6.1.1受检样品种子的扦样、分样和保存，按GB/T3543.2的规定执行。

6.1.2测试样品的数量及淘汰值按GB/T3543.5中的规定执行，见附录E。

6.1.3种子按GB/T3543.4规定的方法发芽，取苗龄一周的叶片提取基因组DNA。

6.2DNA样品提取

a)将2倍CTAB提取缓冲液在65℃水浴中预热。

b)取新鲜叶片约20mm2放入研钵中，加少许石英砂和PVP干粉迅速研磨。

c)将所得研磨物转入2.0mL离心管中，加入900µL预热的2倍CTAB提取缓冲液，65℃水浴保

温30min，每隔10min将离心管上下轻轻摇匀。

d)加入等体积的氯仿/异戊醇，轻轻颠倒离心管10min使其充分混匀，置于高速低温离心机中，

10000r/min离心10min，取上清液转移至另一个1.5mL离心管。

e)重复第d)步。

f)在上清液中加入2/3体积预冷至-20℃的异丙醇，将离心管轻轻摇匀，置于-20℃的冰箱中放置

30min，或者过夜。

g)高速低温离心机10000r/min，4℃离心6min，弃上清液。

h)加入75%的乙醇500µL，高速低温离心机10000r/min离心5min，弃上清液。

i)重复第h)步，置于37℃或者室温下自然风干。

j)按本规程6.3和6.4提供的方法，加入ddH2O溶解DNA，使溶液的DNA浓度至40.0ng/L。DNA

样品置于4℃下待用，或-20℃下储存。

6.3DNA样品质量检测

同时使用下述两种方法对DNA样品进行质量检测，若检测结果不符合两者中的任一要求，应重新提

取DNA。

a)取40µLDNA样品稀释50倍，用紫外分光光度计测定其A260值和A280值。A260/A280的比值

应在1.6-2.0之间。

3

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b)按照附录A.8制备0.80%琼脂糖凝胶，放入电泳槽中，点样孔处于电泳负极端，小心拔下梳子，

加入1倍TAE缓冲液并没过胶面约1.0mm。取4µLDNA样品和1µL6倍loadingbuffer混匀，

加到点样孔中，在另一点样孔中加入λDNA/HindШmarker，电压3V/cm-5V/cm，进行电泳

检测。紫外凝胶成像系统下观察，DNA样品应在23kb处有一条清晰的条带。

6.4DNA浓度计算

DNA样品浓度按公式（1）计算，单位：ng/µL。

DNA样品浓度=A260×50ng/µL×稀释倍数............................(1)

6.5PCR扩增

6.5.1反应体系

反应液体积为20.00µL，组分配制应符合表1的规定。

表1PCR扩增反应体系

反应组分原浓度终浓度反应体积

ddH2O13.80L

10倍Buffer10倍1.250倍2.50L

MgCl225.0mmol/L1.500mmol/L1.20L

dNTP2.5mmol/L0.125mmol/L1.00L

引物10.0mol/L0.200mol/L0.40L

TaqE5.0U/L0.025U/L0.10L

DNA样品40.0ng/L2.000ng/L1.00L

合计20.00L

6.5.2反应程序

PCR扩增程序如图1所示，其中X℃为选用引物的退火温度，见附录B.2：

94℃预变性5min

94℃变性20s

X℃退火1min38个循环

72℃延伸80s

72℃延伸6min

4℃冷却保存

图1PCR扩增反应程序图

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6.5.3PCR扩增产物的检测

按照附录A.8制备1.50%琼脂糖凝胶，放入电泳槽中，点样孔处于电泳负极端，取下梳子，加入1倍

TAE缓冲液并没过胶面约1.0mm。取10LPCR扩增产物和1µL6倍loadingbuffer混匀，加到点样孔中，

在另一点样孔中加入4µL的100bp或200bpDNAmarker，电压3V/cm-5V/cm，进行电泳检测。电泳

结束后，琼脂糖凝胶放入紫外凝胶成像系统，拍照记录。

6.5.4数据记录

对凝胶成像结果进行人工读带，同一引物的扩增产物其电泳迁移率一致的条带为同一位点。各位点

按条带阳性为1、条带阴性为0，记录电泳带谱，排除其中模糊不清的带和无法准确标记的带。对每个样

品的扩增条带进行记录。

6.5.5引物选择

从加拿大BritishColumbia大学设计的100个ISSR引物中，序列见附录B.1，筛选扩增条带清晰、重

复性好的引物。推荐使用的13条引物及其序列见附录B.2。优先使用推荐类型的3条引物，若未获得确

定结果，再依次增加推荐类型的其他引物。

7判定原则

7.1标准数据库的建立

7.1.1按本规程6.5.5选定引物；

7.1.2对标准品种的种子按照本规程的规定进行扩增和记录。标准品种的种子其真实性应准确无误；

7.1.3标准品种应至少涵盖：目标品种及其父本和母本、亲缘关系较近的杂交品种及其父本和母本、

甘蓝型油菜常规品种和白菜型油菜常规品种。各品种应记录13个-20个种子的测定数据。

7.1.4测定数据按NTSYSpc软件的要求，建立数据矩阵。用NTSYSpc软件中按SM遗传相似系数进行

UPGMA聚类；

7.1.5如各品种可以独自聚为一组，该矩阵即为标准数据库；

7.1.6如部分品种不能单独聚为一组，应按本规程6.5.5的规定增加引物进行测定和计算，直至符合

本规程7.1.5的要求。

7.1.7附录C为推荐类型I的3条引物对青杂2号、3号、5号及其各自父本和母本，青油14号和浩

油11号油菜品种进行扩增建立的标准数据库。

7.2标准数据库的补充与修改

选取新品种及其父本和母本的标准种子，标准种子的真实性应准确无误。按照本规程的规定对标准

种子进行扩增，将扩增结果增加到标准数据库中。当标准数据库过大时，可按7.1.3的要求进行删减。

7.3品种判定

将100个待检品种个体的检测数据添加到标准数据库中，用NTSYSpc软件按SM遗传相似系数进行

UPGMA聚类。检测个体与目标品种的标准数据聚为同组的为相同品种，其余为异品种。

7.4品种纯度检测

品种纯度按公式（2）计算，以%表示：

5

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NN

P=TD×100.................................(2)

NT

式中：

P-品种纯度

NT-供检种子粒数（幼苗数）；

ND-判定为异品种的种子粒数（幼苗数）。

7.5种子质量符合性判定

按GB/T3543.5的规定执行，容许差距见附录E。

8报告

按GB/T3543.1的规定执行。

9注意事项

9.1在本规程的操作过程中，凡在接触到溴化乙锭（EB）时，必须带双层一次性聚乙烯手套，在完成

该操作后立即脱去。

9.2加有溴化乙锭（EB）的凝胶及接触到溴化乙锭（EB）的所有物品，须按GB/T19495.2的规定进行

处置。

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附录A

（规范性附录）

溶液的配制

A.12倍CTAB提取缓冲液

称取CTAB10.00g和NaCl40.90g放入烧杯，加入100.00mmol/LTris-HCl50.0mL和0.50mol/LEDTA

20.0mL,慢慢加热使CTAB完全溶解，然后定容至500.0mL，高压灭菌备用，用前加入0.2%的β-巯基乙醇。

A.21.00mol/LTris-HCl

称取Tris12.11g，加ddH2O80.0mL,溶解后边搅拌边加浓盐酸调pH至8.0(约需浓盐酸4.2mL)定容至

100.0mL，高压灭菌。

A.30.50mol/LEDTA

称取EDTANa22H2018.61g溶于80.0mLddH2O中，磁力搅拌机搅拌，用固体NaOH调pH至8.0(约需固体

NaOH2g)，定容至100.0mL，高压灭菌。

A.4氯仿：异戊醇

将氯仿与异戊醇按体积比24:1混合，贮于棕色瓶中。

A.510.00mg/LEB

取EB1.00g溶于100.0mL蒸馏水中，搅拌至完全溶解，分装至用铝箔包裹的1.5mL离心管中。

A.650倍TAE缓冲液

称取Tris242.00g溶于500.0mLddH2O中，加醋酸57.1mL和0.5mol/LEDTA100.0mL，待其完全溶

解后加ddH2O定容至1000.0mL。

A.71倍TAE缓冲液

取50倍TAE20.0mL，加入ddH2O至1000.0mL，充分混匀。

A.8琼脂糖凝胶（0.80%或1.50%）的配制

称取琼脂糖0.80g（或1.50g）置于200.0mL三角瓶中，用1倍TAE100.0mL溶解，在微波炉中融化至

溶液透明，然后冷却至50℃-60℃后，加入EB使其终浓度到0.50µg/mL，混匀后将凝胶倒入制胶模中，

然后在适当位置处插上梳子。凝胶厚度在3.0mm-5.0mm之间，待凝胶完全凝固后放入电泳槽中备用。

7

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AA

附录B

（资料性附录）

表B.1哥伦比亚大学Set#9引物序列

编号序列编号序列

UBC801ATATATATATATATATTUBC851GTGTGTGTGTGTGTGTYG

UBC802ATATATATATATATATGUBC852TCTCTCTCTCTCTCTCRA

UBC803ATATATATATATATATCUBC853TCTCTCTCTCTCTCTCRT

UBC804TATATATATATATATAAUBC854TCTCTCTCTCTCTCTCRG

UBC805TATATATATATATATACUBC855ACACACACACACACACYT

UBC806TATATATATATATATAGUBC856ACACACACACACACACYA

UBC807AGAGAGAGAGAGAGAGTUBC857ACACACACACACACACYG

UBC808AGAGAGAGAGAGAGAGCUBC858TGTGTGTGTGTGTGTGRT

UBC809AGAGAGAGAGAGAGAGGUBC859TGTGTGTGTGTGTGTGRC

UBC810GAGAGAGAGAGAGAGATUBC860TGTGTGTGTGTGTGTGRA

UBC811GAGAGAGAGAGAGAGACUBC861ACCACCACCACCACCACC

UBC812GAGAGAGAGAGAGAGAAUBC862AGCAGCAGCAGCAGCAGC

UBC813CTCTCTCTCTCTCTCTTUBC863AGTAGTAGTAGTAGTAGT

UBC814CTCTCTCTCTCTCTCTAUBC864ATGATGATGATGATGATG

UBC815CTCTCTCTCTCTCTCTGUBC865CCGCCGCCGCCGCCGCCG

UBC816CACACACACACACACATUBC866CTCCTCCTCCTCCTCCTC

UBC817CACACACACACACACAAUBC867GGCGGCGGCGGCGGCGGC

UBC818CACACACACACACACAGUBC868GGAGGAGGAGGAGGAGGA

UBC819GTGTGTGTGTGTGTGTAUBC869GTTGTTGTTGTTGTTGTT

UBC820GTGTGTGTGTGTGTGTCUBC870TGCTGCTGCTGCTGCTGC

UBC821GTGTGTGTGTGTGTGTTUBC871TATTATTATTATTATTAT

UBC822TCTCTCTCTCTCTCTCAUBC872GATAGATAGATAGATA

UBC823TCTCTCTCTCTCTCTCCUBC873GACAGACAGACAGACA

UBC824TCTCTCTCTCTCTCTCGUBC874CCCTCCCTCCCTCCCT

UBC825ACACACACACACACACTUBC875CTAGCTAGCTAGCTAG

UBC826ACACACACACACACACCUBC876GATAGATAGACAGACA

UBC827ACACACACACACACACGUBC877TGCATGCATGCATGCA

UBC828TGTGTGTGTGTGTGTGAUBC878GGATGGATGGATGGAT

UBC829TGTGTGTGTGTGTGTGCUBC879CTTCACTTCACTTCA

UBC830TGTGTGTGTGTGTGTGGUBC880GGAGAGGAGAGGAGA

UBC831ATATATATATATATATYAUBC881GGGTGGGGTGGGGTG

UBC832ATATATATATATATATYCUBC882VBVATATATATATATAT

UBC833ATATATATATATATATYGUBC883BVBTATATATATATATA

UBC834AGAGAGAGAGAGAGAGYTUBC884HBHAGAGAGAGAGAGAG

UBC835AGAGAGAGAGAGAGAGYCUBC885BHBGAGAGAGAGAGAGA

UBC836AGAGAGAGAGAGAGAGYAUBC886VDVCTCTCTCTCTCTCT

UBC837TATATATATATATATARTUBC887DVDTCTCTCTCTCTCTC

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DB63/T1159—2012

表B.1哥伦比亚大学Set#9引物序列（续）

编号序列编号序列

UBC838TATATATATATATATARCUBC888BDBCACACACACACACA

UBC839TATATATATATATATARGUBC889DBDACACACACACACAC

UBC840GAGAGAGAGAGAGAGAYTUBC890VHVGTGTGTGTGTGTGT

UBC841GAGAGAGAGAGAGAGAYCUBC891HVHTGTGTGTGTGTGTG

UBC842GAGAGAGAGAGAGAGAYGUBC892TAGATCTGATATCTGAATTCCC

UBC843CTCTCTCTCTCTCTCTRAUBC893NNNNNNNNNNNNNNN

UBC844CTCTCTCTCTCTCTCTRCUBC894TGGTAGCTCTTGATCANNNNN

UBC845CTCTCTCTCTCTCTCTRGUBC895AGAGTTGTTAGCTCTTGATC

UBC846CACACACACACACACARTUBC896AGGTCGCGGCCGCNNNNNNATG

UBC847CACACACACACACACARCUBC897CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG

UBC848CACACACACACACACARGUBC898GATCAAGCTTNNNNNNATGTGG

UBC849GTGTGTGTGTGTGTGTYAUBC899CATGGTGTTGGTCATTGTTCCA

UBC850GTGTGTGTGTGTGTGTYCUBC900ACTTCCCCACAGGTTAACACA

表B.2推荐的13个ISSR引物

*

引物名称推荐类型引物序列5′-3′退火温度（℃）

UBC825ACACACACACACACACT54.2

UBC834AGAGAGAGAGAGAGAGYT56.0

UBC835AGAGAGAGAGAGAGAGYC53.5

UBC809AGAGAGAGAGAGAGAGG57.5

UBC816CACACACACACACACAT55.2

UBC817CACACACACACACACAA56.5

UBC826ACACACACACACACACC57.0

UBC840GAGAGAGAGAGAGAGAYT58.9

UBC861ACCACCACCACCACCACC62.4

UBC866CTCCTCCTCCTCCTCCTC58.5

UBC880GGAGAGGAGAGGAGA57.2

UBC888BDBCACACACACACACA55.0

UBC891HVHTGTGTGTGTGTGTG56.5

注1：Y=(C,T)；B=(C,G,T)；D=(A,G,T)；H=(A,G,T)；V=(A,C,G)。

注2：*型标记含推荐为首先采用的3个引物，型标记含推荐为候补使用的10个引物。

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DB63/T1159—2012

附录C

（资料性附录）

表C三引物在杂交油菜亲本及子代中的扩增结果

UBC835UBC834UBC825

品种

200300350400450500550600700800850900100012001300140015001800150250300350400450470500550650700750800900100012001300140018003003504004505005506006507007508009001000110012001400

Z5F0111111101111010110011111101110011110001111100101001000

Z5F0411111101101010110011111101110011000001111100101001000

Z5F0711111101101011110011111101110011100001111100101001000

Z5F0811111101101011110011111101110011011001111100101001000

Z5F0911111101111011110011111101110011000001111100101001000

Z5F1011111111101011110011111101110111010001111100101001000

Z5F1111111101101011110011111101110111110