DB13/T 5524-2022 抗豆象绿豆品种真实性和纯度鉴定 SSR 分 子标记法

ICS65.020.01

CCSB05

13

河北省地方标准

DB13/T5524—2022

抗豆象绿豆品种真实性和纯度鉴定

SSR分子标记法

2022-02-28发布2022-03-31实施

河北省市场监督管理局发布

DB13/T5524—2022

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规

定起草。

本文件由河北省农业农村厅提出。

本文件起草单位：河北省农林科学院粮油作物研究所。

本文件主要起草人：刘长友、田静、范保杰、曹志敏、王彦、王珅、苏秋竹、张志肖、王学清、

刘少兴、彭秀国、刘阳。

I

DB13/T5524—2022

抗豆象绿豆品种真实性和纯度鉴定

SSR分子标记法

1范围

本文件规定了SSR分子标记法鉴定抗豆象绿豆（VignaradiataL.）品种真实性和纯度的仪器设

备及试剂、供试样品、方法步骤和结果判断与计算方法。

本文件适用于抗豆象绿豆品种真实性和纯度的检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本

文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T3543.1农作物种子检验规程总则

GB/T3543.2农作物种子检验规程扦样

GB/T3543.5农作物种子检验规程真实性和品种纯度鉴定

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

绿豆象(CallosobruchusChinensis)

绿豆象为鞘翅目、豆象科（Bruchidae)的一种昆虫，又叫中国豆象、小豆象、豆牛，在我国各地

均有发生，主要危害绿豆、小豆、豇豆等。

抗豆象绿豆品种(BruchidsResistantMungbeanVariety)

在人工接种豆象鉴定的条件下，种子被害率小于65%的绿豆品种。

标准样品（StandardSample）

国家指定机构保存的经认定代表品种特征特性的实物种子样品。

品种真实性(VarietalGenuineness)

供检品种与该品种的标准样品是否相符。

品种纯度(VarietalPurity)

品种在特征特性方面典型一致的程度，用与供检品种标准特征特性表现一致的本品种的种子数

占样品种子总数的百分率表示。

SSR分子标记（SimpleSequenceRepeatsMarker）

也称为微卫星DNA(MicrosatelliteDNA)标记，是基于单个微卫星位点的重复单元在数量上的变

异而发展起来一种分子标记。微卫星中重复单位的数目在不同材料中存在高度变异，但其两侧的序

列一般是相对保守的单拷贝序列，根据这一特征设计引物进行PCR扩增，从而可以将单个微卫星位

点扩增出来。由于重复单元的重复数目不同就产生扩增片段长度的多态性，从而形成分子标记。

核心引物（CorePrimers）

从大量引物中筛选出的一组扩增稳定、多态性较好、带型分布合理、能够用于区分不同材料遗

传背景差异的引物组合。

2

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聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）

在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下，依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应，是一种在

体外快速扩增特定基因或DNA片段的方法。

4仪器设备及试剂

仪器设备

高速离心机；PCR扩增仪；高压电泳仪（3000V,400mA,400W）；DNA序列分析电泳槽；电子

天平（0.01g,0.001g）；研钵或组织研磨仪；水浴锅；通风橱；微量加样器（0.5μL～10μL,20

μL～200μL,100μL～1000μL）；磁力搅拌器；胶片观察灯；水平摇床；高压灭菌锅；酸度计；冰箱；

Nanodrop2000分光光度计；烧杯；镊子；量筒；容量瓶（500mL，1000mL）；离心管（1.5mL，2mL）；

吸头(10μL，200μL，1000μL)；96孔PCR板；封板膜；一次性手套；离心管架；染色盒；水平仪；

夹子等。

试剂

十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）；氯化钠；三氯甲烷（氯仿）；异戊醇；β-巯基乙醇；三羟甲基

氨基甲烷（Tris碱）；37%浓盐酸；乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA-2H2O)；氢氧化钠；硼酸；40%非

变性聚丙烯酰胺母液（19:1）；四甲基乙二胺（TEMED）；过硫酸铵；硝酸银；甲醛；乙醇。

注：所有试剂均为分析纯

溶液配制

DNA提取及电泳相关试剂储备液配制见附录B。试剂配制所用水应符合GB/T6682规定的一级水

的要求，其中银染、显影溶液的配制可以使用符合三级水的要求。

5样品

送样

送验样品为种子，重量应不低于500g。

试验样品

从送验样品中随机分取规定数量的试样，试样的分取符合GB/T3543.2的规定。品种真实性鉴定

试样采用混合试样，混合试样应至少含有15个个体；纯度鉴定试样不少于100粒种子；检测样品可以

是种子、胚芽、幼苗或叶片。

6方法步骤

DNA提取

6.1.1取参试样品种子，利用研钵或组织研磨仪研成粉末，置于2mL离心管中，加入800μL65℃

预热的2%CTABDNA提取液(配方见表B.3)，涡旋震荡1min。

6.1.2将离心管置于65℃水浴40min，每10min颠倒混匀一次。将样品从水浴锅中取出，静置

片刻，加入800μL氯仿与异戊醇的混合液（24氯仿:1异戊醇），混匀15min，然后静置10min，

10000r/min室温离心10min。

6.1.3取600μL上清液于另一新的2mL离心管中，加入900μL95%乙醇，-20℃放置30min。

10000r/min离心10min，倒掉上清液，留沉淀。

6.1.4加入500μL75%乙醇，轻轻将沉淀弹起，10000r/min离心5min，倒掉上清液。

6.1.5重复步骤6.1.4一次。

6.1.6将离心管开口朝下倾斜放置，便于多余乙醇流出，室温干燥1h或50℃烘干20min。加入

150μL灭菌ddH2O或1×TE（配方见表B.4），置65℃水浴锅溶解1h。

3

DB13/T5524—2022

6.1.7取出离心管，放置至室温，10000r/min离心2min，将上清液吸取到新的1.5mL离心管

中，以便去除淀粉等沉淀物。

6.1.8利用超微量核酸蛋白检测仪进行DNA浓度测定和质量检测，其OD260与OD280的比值应介于

1.7～2.0之间，并稀释到20ng/μL备用。

PCR扩增

6.2.1PCR反应体系

利用本标准附表A.1中给出的30对绿豆SSR核心引物对受检样品DNA及标准样品DNA进行PCR扩

增。在冰盘中或4℃条件下按表1所列成分和用量,依次加入PCR管,准备PCR反应体系。

表1PCR反应体系

用量

成份

μL

DNA模版（20ng/μL）4

正向引物（2μmol/L）1

反向引物（2μmol/L）1

2×UTaqPCRMasterMix10

ddH2O4

总体积20

注：2×UTaqPCRMasterMix包含UtaqDNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、反应缓冲液，浓度为2×，含溴酚蓝和二甲苯

青电泳指示剂

6.2.2PCR反应程序

按表2程序设置PCR反应流程。

表2PCR反应程序

反应步骤程序设定反应时间备注

195℃预变性5min

295℃变性30s

355℃退火45