WS/T 360-2011 流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群指南

·ICs11,o2o

C50

中华人民共和国卫生行业标准

Ws/T360ˉˉ·

2011

流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群指南

GuideⅡmetry

2011-12-14发布2012-o6-o1实施

中华人民共和国卫生部发布

WS/T360—ˉ

2011

亠

刖曰

本标准按照GB/T1.1—⒛09给出的规则起草。

本标准由卫生部临床检验标准专业委员会提出。

本标准主要起草单位:中国医学科学院北京协和医院。

本标准主要起草人:崔、、王、、

巍黄春梅斐杨卓陈倩。

VVs/T360-ˉ2011

流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群指南

l范围

(T细B细NK细CDlT细

本标准规定了流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群胞、胞、胞、胞和

、果

)的、胞检测和分析结报

CD8+T细,包运、光染色技术流式细仪

胞技术要点括标本采集和输免疫荧

告和审核等方面。

2术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

2.1

分化抗原cIusterofdifferentiation,CD

、、活过程中,出现或消失的细胞表面标志。细胞表面标志通常用单克

不同谱系细胞在分化成熟化

隆抗体来识别。每个抗体都有指定的CD编号,能被特定抗体识别的特定抗原通常具有相同的编号,例

“”“”

tlDl抗

如,被CD1抗体识别的抗原称为原。

2.2

FsC、Fs

eIightscatterFALs、

目亍向散身寸光forwardang【

光学检测器在人射光的正前方所收集的低角度光信号,勹细胞或颗粒的大小和体积有关。

2.3

atter,ssC

侧向散射光side×

光学检测器在人射光的直角处所收集的细胞散射的光信号,与细胞或颗粒的内部和表面结构复杂

程度有关,如细胞质颗粒性、膜不规则性及核形等。

2,4

乏强‘店芰fluorescenceintens"y

亥爿

结合到细胞或颗粒上的荧光素的量。荧光信号的通道数越大提示荧光强度越强。在恰当的条件

下,荧光强度与一个细胞和特定荧光素相结合的位点数相关。

2.5

自发荧光autofIuorescence

未染色细胞白身发出的荧光。通常由嘧啶和黄素核苷酸所产生,白发荧光的强度取决于激发光的

波长,且随所分析细胞的类型和(或)细胞活化状态而改变。通过特殊的标本处理方法可以降低白发荧

光的强度(如丿|j结晶紫孵育)。

2.6

颜色补偿coIorcompensation

由于一种荧光素发射的荧光叠加到其他荧光素发射的波长范围内而造成荧光佶号重叠,通过在其

他荧光信弓巾扣除已测定荧光信号的一部分而纠正颜色重叠造成的计数错误。扣除的荧光量是用恰当

的单染对照来确定的.被校正的信号反映了单荧光信号的发射情况。

2.7

芝

以门gate

(女)来要的目

sC/sSC等所分析

一口光对sSC.「确定的

在流式细胞仪显示的象限图上基于组参数荧

l

Ws/T360-2011

的细胞群.又寸限定区内的目的细胞群通过其他参数(如荧光参数)进一步分析其表达情况。

2.8

双平台方法duaI-pIatformmethodiDP

用于流式细胞术测定细胞绝对计数的一种方法,结果来源于流式细胞仪和第二种仪器的检测。第

二种仪器通常是血细胞分析仪。流式细胞仪用于获取出现于较多量靶细胞群中的目的细胞亚群的比

例,靶细胞群通常是淋巴细胞群或白细胞群。用第工种仪器分析同一标本靶细胞群的绝对浓度ε这两

个测定结果相乘所得即为目的细胞群的绝对浓度。该方法的缺点是包含两种体系的系统误差。

2,9

单平台方法single-platformmethod,sP

用于流式细胞术测定细胞绝对浓度的一种方法,所有结果均来自流式细胞仪一台仪器的测定。浓

度的测定可以直接通过测定体积的方法或问接的通过加入已知浓度的荧光微球来计算。单平台方法免

去了第二台仪器的所产生的系统误差。

3试剂

3,1荧光素标记的单克隆抗体

采用荧光素直接标记的单克隆抗体(单抗),称直标抗体。选择直标抗体是淋巴细胞亚群分析的关

键步骤,要考虑所选抗体对细胞的反应性。

3。1.1单抗

CD45、CD3、CD4、CD8、CD19、CD16、CD56。

3.1.2单抗对细胞的反应性

CD45表达于所有白细胞;CD3表达于T淋巴细胞;CD4表达于T辅助/诱导淋巴细胞(CD4+T细

胞)和单核细胞;CD8表达于细胞毒T细胞(CD8·T)和NK细胞;CD19表达于B淋巴细胞;CD16表达

于NK细胞、巨、

单核噬细胞粒细胞和树突状细胞等;CD56表达于NK细胞和细胞毒T细胞。

3.1.3单抗对淋巴细胞亚群的鉴定

CD4、CD8、CD16和CD56单抗均不能特异性标记淋巴细胞某一亚群。采用CD45和(或)CD3作为

设门抗体,同时兼做质控试剂。CD3_T细胞标记为CD3_,CD4ˉT细胞标记为CD3÷CD4ˉ,CD8ˉT

细胞标记为CD3ˉCD8+,B细胞标记为CD3CD19_,NK细胞标记为CD3CD56+或CD3CD(16+

56),。

3,1,4直标抗体常用荧光染料

异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE/RD1)、藻红蛋白偶联物(PECY5)、多甲藻叶绿素蛋白

(Pe￡-德(ECD)和(APC)。

P)、藻红蛋白州红偶联物别藻青蛋白除别藻青蛋白(APC)外,其他荧光染

用488nm的525nm、

料均采,最575nm、

激发光源670nm、

激发发675nm和

大射波长分别为613nm。

别藻青蛋白(APC)的激发光源为630nm,最660nm。

大发射波长为

3.2溶血素

使用与仪器相匹配的溶血素(内含固定液),并严格按照使用说明和注意事项进行操作。如果使用

没有固定作用的溶血剂(如氯化铵和低渗缓冲液等),染色后标本需要保存在4℃,并在1h内

完成上机

2

Ws/T360-ˉ2011

检测。

3.3定量微球

用于淋巴细胞亚群绝对计数。常用的商品化荧光微球包括Flow-C。

FCSCCountStandardtM(FlowC~vt°

metryStandardsCorporaton)和

TruCountTM(BectonEkkns°

ω等。

4标本采集和处理

4.1生物安全

血液和体液标本中可能存在致病性甚至致死性的活体病原微生物,所有标本都应当作潜在传染源

来处理。

4.1.1标本采集

避免被针头刺伤,针头丢弃人利器盒中,严禁复帽、、

弯曲折断针头或者从注射器上取下针头。

4.1,2安全着装

所有接触血液标本的人员都应戴手、工

套穿实验室作服。当标本处理过程中有飞溅的可能性,应带

口和,避口

好罩防护眼罩免眼、、

鼻等部位接触标本。在所有工作结束后和离开实验室前,应脱掉手套并

洗手。

4.1.3生物安全柜(BsC)

所有的操作都应该在生物安全柜中进行(I类或Ⅱ类BSC);即使条件不允许,对于可能产生微粒

或气溶胶的操作(如涡旋、开)仍BSC中

打真空管等需要在进行。

4.1.4离心

标本离心时需要放在封闭的容器中,避免气溶胶形成。

4.1.5吸旦

应用手工或电动移液器,严禁用嘴吸量。

4.1.6利器

避免使用利器,如针头、巴、

玻璃斯德移液管玻璃容器等。

4.1.7血液溢洒

血液溢洒时,立即用合适的试剂擦拭干净,如1:10稀释的新鲜配制的0.71mol/L次(未

氯酸钠稀

释的家用漂白剂)或适当稀释的医用消毒剂。

4.1.8废弃物处理和标本灭活

实验室废弃物处置的理、,所

管应符合国家地方的相关要求有不再需要的标本和其他生物材料应弃

置于套有生物危险标志的黄色密封且防漏的塑料袋的容器内,用过的针头等利器应放人利器盒中。

实验室标本需要事先灭活处理,将标本与广谱碘伏和漂白混24h后

剂合作用再进行适当处理。由

于漂白剂与氯化铵作用可产生有毒的氯气,故漂白剂不能用于处理含有氯化铵的溶液。

3

Ws/T360-—2011

4.1.9固定液

0.1%~2,0%多

聚甲醛或甲醛缓冲液是常用的固定液,用于对感染的标本在分析前进行灭活,能够

灭活HⅣ等病毒的3个~5个

对数级的病毒载量。在染色过程中的最后一次离心后,用含有多聚甲醛

或甲醛缓冲液(pH7,0~7,4)处

理,4℃保存待测。建议每周配置新鲜的多聚甲醛或甲醛缓冲液。使用

含有罔定液成分的商品化裂解液时,无需再重复使用多聚甲醛或甲醛缓冲液。

4.1,10非固定标本

对于非固定标本,实验室应制定合适的生物安全规则以将感染病原体的暴露降到最小。由于暴露

在空气中的流式细胞仪液流系统产生的气溶胶具有潜在的危险,所以应提高警惕,严格按照制造商的生

物安全建议进行操作。

4.1.ll

设备消毒

流式细胞仪的废液桶中需要装有占其体积1/10的0.71mol/L次(未

氯酸钠稀释的家用漂白剂)。

实验室设备应该用具有灭活传染源作用的溶液或新配制的10%家用漂白剂消毒,尤其在设备维修和保

养前给予严格消毒。

4.2标本标识

所有检测用标本应及时贴上标签,标签上应注有患耆的姓、一

名患者唯的识码、、

别检测项目标本采

的日和,必

集期时间要时标注检测实验室。如果使用检查申请单,申请单应和标本粘贴在一起送检,申

请单上应标明患、

者的姓检、、

名测项目年龄性、日

别标本采集期和时间、医

申请生的姓名和标本类型

(如:全血),必要时标注检测实验室。

4.3抗凝剂和采集容器

首选乙二胺四乙酸盐(EDTA-K2/EDTA-K3)抗凝真空管进行标本采集,亦可采用肝素钠抗凝或枸

橼酸钠抗凝(ACD)的真空管进行采集,EDTA盐抗凝标本在室温下稳定保存12h~24h,超30h的

过

EDTA盐抗凝标本中粒细胞可能会减少,肝素钠或枸橼酸钠抗凝标本可稳定保存至48h。如果标本用

血细胞分析仪同时进行白细胞计数和分类,则应该选择EDTA盐作为抗凝剂。

4.4标本质量

4.4.1标本目观

视察

可观察到的标本问题常见有两种类型:一是变性或损坏的标本,这需要立即弃之。二是在标本处理

过程中出现错误操作,这需要进行进一步评价。错误操作问题需要记录下来,这对标本的处理、以

分析

及结果的解释都很有帮助。

4.4.2溶血

严重溶血的标本应该放弃检测,所有可能破坏标本完整性的异常情况均应密切观察,并且记录下

来,以利于后续的处理、和。

分析结果解释

4,4.3凝血

即使是很小的血凝块也会引起血液中某些成分的选择性丢失或改变,凝血的标本尽可能弃用。

4.4.4温度极限

如果标本是通过长距离的路程送到实验室的,标本就有可能暴露在非允许储存温度的环境中,所以

4

、Vs/T360-ˉ

2011

接到标本后应确认标本是否过热或过冷。即使其他所有的鉴定标准都正常,也应记录下来以利于后续

的处理、和。

分析结果解释

4.4.5错误标本标签

如果标本没有唯一标识或标本标签与患者信息不符(患者姓名与标识不符),应该拒收标本,并及时

与相关医护人员沟通。

4.4.6标本保存时间及储存条件

可接受的标本最长保存时间取决于抗凝剂的种类、血、

溶剂储存条件及细胞浓度。实验室应该根据

使用的抗凝剂和溶血剂确定可接受的标本最长保存时间。实验室应选择适当的保存环境以及溶血方

法,使保存标本的检测结果与新鲜标本之间没有明显差别。原则上标本采集后应该立即检测,但是实际

操作中往往无法做到。不能立即检测的(18℃~25℃

标本应该保存于室温)环境中。后续的标本处理

和免疫染色应严格按照试剂说明书进行。

4,4,7标本处理方法

采用全血溶血法,以便尽可能地回收所有的白细胞。但对于慢性肝病或高脂血症等患者的标本,由

于脂质代谢异常导致红细胞脆性下降,溶血素常常无法完全裂解红细胞,需要采用密度梯度离心法;但