DB22/T 1589-2012 高粱品种鉴定 DNA指纹法（SSR）

ICS65.020

B05

备案号：35077-2012DB22

吉林省地方标准

DB22/T1589—2012

高粱品种鉴定DNA指纹法（SSR）

Identificationofsorghum(Sorghumbicolor(L.)Moench)varietiesusingDNA

fingerprintingmethod(SSR)

2012-09-15发布2012-10-31实施

吉林省质量技术监督局发布

DB22/T1589—2012

前言

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。

本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2001给出的规则起草。

本标准由吉林省农业委员会提出并归口。

本标准起草单位：吉林省农业科学院农业部植物新品种测试(公主岭)分中心、农业生物技术研究所。

本标准主要起草人：李晓辉，王凤华，张春宵，周海涛，郝彩环，王威，侯佳明，王晶。

I

DB22/T1589—2012

高粱品种鉴定DNA指纹法（SSR）

1范围

本标准规定了利用简单重复序列（SSR,simplesequencerepeat）分子标记进行高粱(Sorghumbicolor

(L.)Moench)品种DNA指纹鉴定的试验方法、数据采集、结果记录及判定标准。

本标准适用于高粱各类材料的DNA分子数据采集和品种鉴定。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T3543.2农作物种子检验规程扦样

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T19557.1植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南总则

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

核心引物coreprimer

多态性、稳定性、重复性等综合特性好，可作为DNA指纹鉴定优先选用的一套SSR引物，包括基本核

心引物和扩展核心引物。基本核心引物是用于品种建库和鉴定，并且保证不同实验室数据具有可比性，

可进行数据整合的一套统一固定引物。扩展核心引物是可根据引物的最新研究结果和特殊鉴定性状进行

调整的一套相对固定的引物。

3.2

参照品种referencecultivar

用于确定等位变异，校正仪器设备的系统误差,对应于特定SSR位点上大小已知的不同等位变异的一

组品种。

4原理

从高粱种子、幼苗、叶片等组织中提取DNA，利用普通或荧光染料标记的SSR引物进行PCR扩增。

不同长度的PCR扩增片段通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，经硝酸银染色或者荧光染料标记检测区分

开来。不同高粱品种由于遗传组成不同，在基因组DNA的多个SSR位点中，一些位点的简单重复序列的

重复次数有差异，这种差异可通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳区分，从而对不同品种进行区分鉴定。

1

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5试剂与材料

除另有说明外，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和GB/T6682规定的一级水。

5.1试剂

5.1.1十六烷基三乙基溴化铵（CTAB:C16H33(CH3)3NBr）。

5.1.2乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2·2H2O:C10H14N2Na2O8·2H2O）。

5.1.3三羟甲基氨基甲烷（tris-base:C4H11NO3）。

5.1.4氢氧化钠（NaOH）。

5.1.5氯化钠（NaCl）。

5.1.6琼脂糖（agarose）。

5.1.7溴酚蓝（brphblue:C19H10Br4O5S）。

5.1.8二甲苯青FF（C25H27N2O6S2Na）。

5.1.9甲叉双丙烯酰胺（bisacrylamide:(H2C=CHCONH)2CH2）。

5.1.10丙烯酰胺（C3H5NO）。

5.1.11硼酸（boricAcid:H3BO3）。

5.1.12尿素（CH4N2O）。

5.1.13过硫酸铵（APS:(NH4)2S2O8）。

5.1.14乙酸铵（CH3COONH4）。

5.1.15硝酸银（AgNO3）。

5.1.16三氯甲烷（CHCl3）。

5.1.17异丙醇（C3H8O）。

5.1.18异戊醇（C5H12O）。

5.1.19盐酸（HCl）：37%。

5.1.2010×Buffer缓冲液:含Mg2+25mmol/L。

5.1.21四种脱氧核苷三磷酸:dATP、dTTP、dGTP、dCTP（10mmol/Leach）。

5.1.22TaqDNA聚合酶：2U/mL。

5.1.23矿物油。

5.1.24去离子甲酰胺（formamide:HCONH）。

5.1.25亲和硅烷（bindingsilane）:97%。

5.1.26剥离硅烷（repelsilane）:2%二甲基二氯硅烷（C2H6Cl2Si）。

5.1.27无水乙醇（C2H6O）。

5.1.28四甲基乙二胺（TEMED:C6H16N2）。

5.1.29冰醋酸（C2H4O2）。

5.1.30甲醛溶液（CH2O）:37%。

5.1.31DNA分子量标准:DL2000。

5.1.32核酸染色剂。

5.1.33DNA分析仪专用丙烯酰胺胶液。

5.1.34DNA分析仪专用电泳缓冲液。

5.1.35DNA分析仪专用分子量内标Liz标记。

5.1.36DNA分析仪专用光谱校准基质，6-FAM荧光标记的DNA片段。

5.2试剂配制

2

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5.2.1DNA提取试剂的配制

5.2.1.1EDTA溶液（0.5mol/L）

186.1gEDTA-Na2·2H2O溶于800mL水中，用NaOH调pH值至8.0，定容至1000mL，103.4kPa灭菌。

5.2.1.2Tris-HCl溶液（1mol/L）

60.55gTris-base溶于适量水中，加HCl调pH至8.0，定容至500mL，103.4kPa灭菌。

5.2.1.3HCl溶液（0.5mol/L）

25mL浓盐酸(36%-38%)，加水定容至500mL。

5.2.1.4NaCl溶液（5mol/L）

292.5gNaCl+ddH2O至终体积1000mL，103.4kPa灭菌。

5.2.1.5DNA提取CTAB缓冲液

1mol/LTris-HCl83.5mL，5mol/LNaCL235mL，0.5mol/LEDTA33.4mL，CTAB固体20g，定容

至1000mL。

5.2.1.6氯仿-异戊醇(24:1)

按24:1的比例（体积比）配制混合液。

5.2.1.776%乙醇

无水乙醇380mL，定容至500mL。

5.2.1.8TE缓冲液

1mol/LTris-HCl5mL，0.5mol/LEDTA1mL，加HCl调pH至8.0，定容至500mL。

5.2.2dNTP的配制

用超纯水分别配制A、G、C、T终浓度100mmol/L的储存液。各取20μL混合，用超纯水120μL定容

至每种核苷三磷酸终浓度为10mmol/L的工作液。103.4kPa灭菌，-20℃保存。

5.2.3变性聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂的配制

5.2.3.140%PAGE胶

190g丙烯酰胺和10g甲叉双丙烯酰胺，定容至500mL，混匀。4℃贮存备用。

5.2.3.26%PAGE胶

尿素450g，10×BTE缓冲液100mL，40%PAGE胶150mL，定容至1000mL。

5.2.3.3亲和硅烷工作液

250μL冰醋酸，250μL亲和硅烷，加无水乙醇至50mL，混匀。分装于1.5mLEppendorf管中。4℃

贮存备用。

5.2.3.4剥离硅烷工作液

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2%二甲基二氯硅烷。

5.2.3.525%过硫酸铵溶液

0.25g过硫酸铵溶于1mL超纯水中，混匀。

5.2.3.610×TBE缓冲液

Tris-base108g，硼酸55g，EDTA-Na2·2H2O7.44g，定容至1L。

5.2.3.71×TBE缓冲液

10×TBE缓冲液500mL，加水定容至5L。

5.2.3.86×加样缓冲液

去离子甲酰胺（用于DNA变性）49mL，0.5mmol/LEDTA1mL，溴酚兰0.125g，二甲苯青0.125g。

5.2.4银染试剂的配制

5.2.4.1固定液

200mL冰醋酸，加水定容至2000mL。

5.2.4.2染色液

3g硝酸银，加水定容至2000mL。

5.2.4.3显影液

2000mL蒸馏水中加入25g氢氧化钠和7mL甲醛。

注1：银染溶液的配制可使用符合GB/T6682规定的三级水。

注2：同样标准的试剂盒可代替上述试剂。

6仪器设备

6.1DNA分析仪：基于毛细管电泳，有片段分析功能和数据分析软件，能够分辨1个核苷酸大小的差

异。

6.2紫外分光光度计：波长260nm及280nm。

6.3酸度计。

6.4电子天平：感应为0.01g、0.001g。

6.5凝胶成像系统或紫外透射仪。

6.6PCR扩增仪。

6.7高压电泳仪：规格为3000V、400mA、400W，具有恒电压、恒电流和恒功率功能。

6.8垂直电泳槽及配套的制胶附件。

6.9普通电泳仪。

6.10水平电泳槽及配套的制胶附件。

6.11高速冷冻离心机：最大离心力不小于15,000rpm。

6.12水平摇床。

6.13胶片观察灯。

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6.14微量移液器：规格分别为10mL、20mL、100mL、200mL、1000mL，连续可调。

6.15磁力搅拌器。

6.16微波炉。

6.17高压灭菌锅。

6.18水浴锅或金属浴：控温精度±1℃。

6.19冰箱：最低温度-20℃。

6.20制冰机。

7SSR引物

用超纯水分别配制正向引物和反向引物终浓度均为20μmol/L，等体积混合成10μmol/L的工作液。

引物在DNA分析仪上使用时，须在正向引物5′端加入6-FAM荧光修饰基团。引物清单见附录A。

8参照品种及其使用

在进行等位变异检测时，应同时包括相应参照品种的PCR扩增产物。若多个品种在某一SSR位点上

都具有相同的等位变异。在确认这些品种该位点等位变异大小与参照品种相同后，这些品种也可以代替

资料附录B中的参照品种使用。若同一名称不同来源的参照品种的某一位点上的等位变异不相同，在使

用其他来源的参照品种时，应与原参照品种核对，确认无误后使用。对于附录B中未包括的等位变异，

应按本标准方法，确定其大小和对应参照品种。参照品种的名称参见附录B。

9操作步骤

9.1试样制备

9.1.1样品材料可为种子、幼苗、植株幼嫩叶片等组织或器官。对于种子样品分样和保存，按GB/T

3543.2的规定进行。

9.1.2每份样品随机取10个个体（种子、叶片或其他等效物）进行分析。

9.2DNA提取

DNA提取步骤如下：

a)称取500mg幼苗，液氮下迅速磨成粉末；

b)将粉末转入2.0mLEppendorf管中，加入700μL65℃预热的CTAB缓冲液，并使其混匀；

c)65℃水浴加热45min，不断地轻轻倒转摇动。水浴后，取出离心管，冷却至室温；

d)通风橱下加入700μL的氯仿:异戊醇（24:1），轻轻倒转摇动5min～10min；

e)12000rpm(室温)离心10min，用去头枪尖将上清转至一新2.0mLEppendorf管中；

f)加入10μLRNA酶溶液（10mg/mL），37℃下温浴30min；

g)重复4～5步骤；

h)加入-20℃预冷的异丙醇（1倍体积）或无水乙醇（2倍体积）于2.0mLEppendorf管中，轻

轻混匀。-20℃冰箱静置一段时间后，至DNA凝集，室温下钩出DNA；

i)76%乙醇洗涤两次（其中一次可过夜）。洗涤完毕后，将DNA晾干；

j)加入适量的1×TE(pH8.0)溶解于试管中，4℃下保存备用；

k)将DNA原液于0.8%琼脂糖凝胶电泳检测质量（DL2000为Marker)。-20℃下保存备用。

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注1：利用种子、幼苗、植株幼嫩叶片等组织或器官提取DNA均可，但鉴于高粱的种子籽粒较小，本标准推荐

使用幼苗。

注2：上述DNA提取方法为标准推荐使用的，在保证DNA提取质量的前提下其它DNA提取方法均可采用。

注3：杂交种种子应为当代种子，常规系及其他类型种子应为纯合种子。

9.3PCR反应体系及程序

9.3.1反应体系

10µL的反应体积，含每种dNTP0.10mmol/L，正向、反向引物各0.24mmol/L（利用DNA分析仪检

测时使用荧光标记引物），TaqDNA聚合酶0.4U，1×PCR缓冲液（含Mg2+2.5mmol/L），样品DNA20

ng～40ng，其余以超纯水补足至所需体积。如果PCR过程中不采用热盖程序，则反应液上加盖15μL矿

物油（Sigma），以防止反应过程中水分蒸发。

9.3.2反应程序

94℃预变性5min，1个循环；94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸60s，共36个循环；72℃

延伸10min，4℃保存。

9.4电泳检测

9.4.1普通变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测

9.4.1.1灌胶板制作

灌胶板制作步骤如下：

a)严格地将玻璃板洗净；

b)蒸馏水冲洗并擦干；

c)用95%酒精擦拭；

d)在母板上均匀涂2mL～3mL亲和硅烷工作液，凹槽板上涂2mL～3mL剥离硅烷。放置10min

以上，让其充分晾干。操作过程中防止两块玻璃板相互污染。

9.4.1.2组装玻璃板

待玻璃板彻底干燥后组装电泳板，并用水平仪调平。

9.4.1.3灌胶

在50mL6%PAGE胶中加入TEMED65μL和25%的过硫酸铵250μL，迅速混匀后灌胶。待胶液流动

到下部，在上部轻轻插入梳子，使其凝聚至少1h以上。灌胶过程中防止出现气泡。

9.4.1.4预电泳

在正极槽（下槽）中加入1×TBE缓冲液600mL，在负极槽（上槽）中加入0.5×TBE缓冲液600mL，

拔出梳子。80W恒功率预电泳30min～40min。

9.4.1.5试样制备

10μLPCR扩增样品加入3μL6×加样缓冲液，混匀后，在94℃变性10min，迅速用冰水浴冷却，

并于-20℃冰箱中冷却10min以上。

9.4.1.6电泳

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用移液器吹吸加样槽，清除残胶和气泡，插入样品梳子，每一个加样孔点入4μL样品。70W恒功

率电泳至上部的指示带（二甲苯青）达到胶板的中部（45min～50min）。电泳结束后，小心分开两块

玻璃板，胶会紧贴在涂亲和硅烷的玻璃板上。

9.4.1.7银染

银染步骤如下：

a)固定：将凝胶板置于装有固定液的塑料盒内，轻轻摇荡10min；

b)漂洗：双蒸水漂洗3min；

c)染色：在新配染色液中，轻轻摇荡20min；

d)漂洗：双蒸水漂洗，时间不超过10s；

e)显影：在显影液中、轻轻摇荡，直至出现带纹；

f)定影：在固定液中定影2min；

g)漂洗：用1.5L双蒸水漂洗2min；

h)干胶：室温下自然晾干。

9.4.2DNA分析仪检测

DNA分析仪检测的具体过程参照相对应仪器型号的操作说明书。

10等位变异数据采集

10.1数据表示

样品每个SSR位点的等位变异采用扩增片段大小的形式表示。

10.2数据采集

10.2.1普通变性聚丙烯凝胶电泳数据采集

将待测样品扩增片段的带型和迁移位置与对应的参照品种进行比较，与待测样品相同的参照品种的

片段大小即为待测样品该引物位点的等位变异大小。

10.2.2DNA分析仪数据采集

使用DNA分析仪的片段分析软件，读出每个位点每个样品的等位变异片段大小数据。通过使用参

照品种，消除同型号不同批次间或不同型号DNA分析仪间可能存在的系统误差。比较参照品种的等位

变异片段大小数据与附录B中的数据。如两者不一致，确定系统误差的大小。从待测样品的等位变异数

据中去除该系统误差。

10.3结果记录

10.3.1普通变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果记录

将每个核心引物位点的所有谱带按扩增片段从小到大的顺序编号，用二位代码描述（依次为01、

02……），对照参照品种的谱带确定待测样品的基因型。纯合位点的等位变异数据记录为X/X，其中X

为该位点谱带的代码；杂合位点的等位变异数据记录为X/Y，其中X、Y为该位点上两个不同的谱带。

小片段在前，大片段在后。无效等位变异记录0/0。

7

DB22/T1589—2012

示例1：以附录B中的引物Txp482为例，参照品种TX430在该核心引物位点上仅有一条谱带03，在该引物位点的

谱带代码记录为0303；

示例2：以附录B中的引物Txp494为例，参照品种TX430在该核心引物位点上有两条谱带03和06，在该引物位点

的谱带代码记录为0306。

10.3.2DNA分析仪结果记录

纯合位点的等位变异数据记录为X/X，其中X为该位点等位变异的大小；杂合位点的等位变异数据

记录为X/Y，其中X、Y为该位点上两个不同的等位变异。小片段在前，大片段在后。

示例1：以附录B中的引物Txp482为例，参照品种TX430在该核心引物位点上有一个等位变异，大小为231bp，

则该品种在该引物位点上的等位变异数据记录为231/231；

示例2：以附录B中的引物Txp494为例，参照品种TX430在该核心引物位点上有两个等位变异，大小分别为203bp、

215bp，则该品种在该引物位点上的等位变异数据记录为203/215。

11判定标准

11.1直接比较

11.1.1对两个或两个以上的品种同时进行检测时，先用附录A.1中20对基本核心引物检测，获得待

测品种在这些引物位点的等位变异数据，利用这些数据进行品种间比较。品种间差异位点数≥2，判定

为不同品种。

11.1.2对品种间差异位点数=0、1的情况，继续用附录A.2中20对扩展核心引物进行检测，利用全

部引物位点的等位变异数据进行品种间比较：

a)品种间差异位点数≥2，判定为不同品种；

b)品种间差异位点数＝1，判定为近似品种；

c)品种间差异位点数＝0，判定为疑同品种。

对于b)和c)的情况，按GB/T19557.1的规定进行田间鉴定。

11.2数据库比较

对待测品种进行检测后利用其检测数据和数据库中品种的数据进行比对时，先用附录A.1中20对基

本核心引物检测，获得待测品种在上述引物位点的等位变异数据，利用这些数据和数据库中品种进行比

较：品种间差异位点数≥2，判定为不同品种。

对品种间差异位点数=0、1的情况，将这些相近品种或疑同品种与待测品种按照11.1.2的方法进行

鉴定。

8

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AA

附录A

（规范性附录）

引物清单

表A.120对基本核心引物清单

序号标记名称染色体正向引物（5′-3′）反向引物（5′-3′）

1Txp482SBI01ATGTGTCCAGCCATGCATAACTCATGTAGGGGCGAGTGTC

2Gpsb089SBI01ATCAGGTACAGCAGGTAGGATGCATCATGGCTGGT

3Cup26SBI02CGATCATCAGATCATGGGAGCACTTGGGAAG