GB/T 22917-2008 猪水泡病病毒荧光RT-PCR检测方法

ICS11.220

B41

中华人民共和国国家标准

GB/T22917—2008

猪水泡病病毒荧光RT-PCR检测方法

ProtocoloffluorogenicRT-PCRforswinevesiculardiseasevirus

2008-12-31发布2009-05-01实施

发布

GB/T22917—2008

-1.Z-—1—

刖弓

本标准参考了世界动物卫生组织（（）IE）《陆生动物诊断试验和疫苗手册（哺乳动物、禽鸟与蜜蜂）》

（第5版）。

本标准的附录A为规范性附录。

本标准由中华人民共和国农业部提出。

本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口。

本标准起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中华人民共和国云南出入境检验检

疫局c

本标准主要起草人:花群义、卢体康、吕建强、阮周曦、杨云庆、周晓黎、杨素、董俊、陈书琨。

T

GB/T22917—2008

猪水泡病病毒荧光RT-PCR检测方法

1范围

本标准规定了猪水泡病病毒荧光RT-PCR检测的操作方法。

本标准适用于动物及其产品中猪水泡病病毒的检测。

2缩略语

下列缩略语适用于本标准。

2.1荧光RT-PCR

荧光反转录-聚合酶链反应。

2.2Ct值

每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值吋所经历的循环数。

2.3RNA

核糖核酸。

2.4DEPC

焦碳酸磷酯。

2.5PBS

磷酸盐缓冲盐水，配方见附录Ao

2.6Taq酶

TagDNA聚合酶。

2.7SVDV

猪水泡病病毒。

3原理

根据猪水泡病病毒的基因特定序列，合成一对特异性引物和一条特异性的荧光双标记探针。引物

和探针通过严格的设计和筛选，涵盖已报道的所有猪水泡病病毒的毒株。荧光探针的5'端标记FAM

荧光素，3'端标记TAMRA荧光素，它在近距离内能吸收5’端报告荧光基团发出的荧光信号。扩增吋，

由于八旳酶的5'*3‘的外切活性，在延伸到荧光探针吋，将其切断，两基团分离，淬灭作用消失，荧光信

号产生。因此，可以通过检测荧光信号对核酸模板进行检测。

4材料与试剂

4.1仪器与器材

4.1.1荧光RT-PCR检测仪。

4.1.2高速台式冷冻离心机（离心速度12000r/min以上）。

4.1.3台式离心机或手掌式离心机（离心速度3000r/min）o

4.1.4混匀器。

4.1.5冰箱（2°C〜8°C和一20°C两种）。

4.1.6微量可调移液器（5mL,10mL,100mL,1000ML）及配套带滤芯吸头。

4.1.71.5mL.O.5mL硅化Eppendorf管:将Eppendorf管和滴头浸泡于含有0.1%DEPC的三蒸水

中过夜，121°C±2C高压灭菌15min,40°C烘干备用。市售Eppendorf管和滴头已经硅化，可直接

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GB/T22917—2008

使用。

4.1.80.2mL透明薄壁PCR管。

4.1.96X6孔或5X8孔冰盒。

4.1.10水浴锅：0"C〜100°C。

4.1.11旋涡振荡器。

4.2试剂

4.2.1本标准所用试剂均为分析纯，所有试剂均用无RNA酶污染的容器(用DEPC水处理后高压灭

菌)分装。

4.2.2三氯甲烷。

4.2.3异丙醇：一20C预冷。

4.2.4PBS：配制方法见附录A。

4.2.575%乙醇：用新开启的无水乙醇和DEPC水配制，一20C预冷。

4.2.6裂解液：配制方法见附录A。

4.2.7酚(分析纯)。

4.2.8无水乙醇(分析纯)。

4.2.9AMV反转录酶(5U/mL)：—20C保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。

4.2.10dNTPs：含dCTP、dGTP、dATP、dTTP各10mmoL/Lo

4.2.11RNA酶抑制剂(RNasin,40U/ML)：-20€保存，不要反复冻