GB/T 18420.2-2009 海洋石油勘探开发污染物生物毒性 第2部分：检验方法

ICS13.030.20

Z17

中华人民共和国国家标准

GB/T18420.2—2009

代替GB/T18420.2—2001

海洋石油勘探开发污染物生物毒性

第2部分:检验方法

Biologicaltoxicityforpollutantsfrommarinepetroleumexploration

anexploitation—Part2:Testmetho

2009-03-11发布2009-11-01实施

发布

GB/T18420.2—2009

目次

前言I

1范围1

2规范性引用文件1

3术语和定义1

4原理1

5采样、送样和样品保存2

6实验生物2

7设施和设备3

8试验程序4

9试验结果分析和判断6

10质量控制6

11检验报告6

附录A（资料性附录）生物毒性试验结果原始记录表7

附录B（规范性附录）生物毒性试验结果判定流程图11

附录C（资料性附录）LG（，和EG。的计算方法13

附录D（资料性附录）Spearman-Karber计算法和TrimmedSpearman-Karber计算法17

附录E（资料性附录）正态性检验和方差齐性检验19

附录F（资料性附录）Dunnett's检验和Steel's多对一秩检验22

附录G（资料性附录）生物毒性检验报告表26

参考文献27

GB/T18420.2—2009

-1.Z-—1—

刖弓

《海洋石油勘探开发污染物生物毒性》分为两个部分：

——第1部分:分级；

——第2部分:检验方法。

本部分为第2部分。

本部分代替GB/T18420.2—200K海洋石油勘探开发污染物生物毒性检验方法》。

本部分与GB/T18420.2-2001相比主要变化如下：

—将“96h换水式生物毒性试验”的术语和定义修改为“静水式生物毒件试验”的术语和定义

（2001年版的3.2,本版的3.1）,增加了“半数有效浓度”的术语和定义（本版的3.4）；

-在“采样、送样和样品保存”一条中增加了关于“基液”的内容（本版的5.1.1和5.1.2.2）；

——在“实验生物”一章增加了4种实验生物及其相关内容（本版的6.1-6.4）；

-增加了“基液”和“合成基钻井液”的贮备液配制方法（本版的&1.2.1.3和&1.2.2）；

——增加了以生长作为观测指标的生物毒性试验方法的相关操作（本版的&4.6.2.2）；

—修订了“结果的有效性”的部分内容（2001年版的10.1,本版的9.1）；

—

-在附录中增加了部分数据处理和结果计算的方法示例，以及生长毒性试验的原始记录表（本版

的附录A〜附录F）。

本部分的附录B为规范性附录，附录A、附录C、附录D、附录E、附录F、附录G为资料性附录。

本部分由国家海洋局提出。

本部分由全国海洋标准化技术委员会（SAC/TC283）归口。

本部分起草单位：广东省实验动物监测所、国家海洋局南海分局。

本部分起草人：黄韧、魏社林、吴进孝、郑琰晶、王颖、王国栋、周锦。

本部分所代替标准的历次版本发布情况为：

——GB/T18420.2—20010

T

GB/T18420.2—2009

海洋石油勘探开发污染物生物毒性

第2部分：检验方法

1范围

本部分规定了海洋石油勘探开发作业中使用或生成后并排入海洋的部分污染物在生物毒性检验中

采用的试验方法，以及试验方法中有关样品的处理、实验生物、试验程序、结果判定、质量控制等要求。

本部分适用于海洋石油勘探开发作业中使用或生成后并排入海洋的钻井液、基液、钻屑和生产水的

生物毒性检验，本部分限定外的污染物的生物毒性检验可参照使用’

2规范性引用文件

下列文件中的条款通过本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有

的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究

是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。

GB1737&3海洋监测规范第3部分:样品采集、贮存与运输

GB17378.4-2007海洋监测规范第4部分:海水分析

3术语和定义

下列术语和定义适用于本部分。

3.1

静水式生物毒性试验staticbiologicaltoxicitytest

试验期间内不更换试验溶液，进行观察、测定生物异常或死亡效应的试验。

3.2

无可见影响浓度noobserveeffectconcentration（NOEC）

实验生物暴露在一组不同浓度的试验溶液一定时间后，通过观察实验生物的不良影响，并比较试验

组与对照组统计分析结果，判定出对实验生物无显著影响的最大浓度。

3.3

半数致死浓度halflethalconcentration

LC5（）

在一定观察期内，造成50%的受试生物死亡的毒物浓度。

:GB17378.7—2007,定义3.10]

3.4

半数有效浓度halfeffectiveconcentration

EC50

在一定观察期内，引起50%受试生物产生某一特定效应，或者是实验生物的某效应指标被抑制一

半时的毒物浓度，以EG。表示。

4原理

海洋生物的各种生理活动受海洋环境影响，通过观察测定实验生物在一定试验期间内接触试验物

质后的异常或死亡效应，得到海洋石油勘探开发污染物对实验生物有明显影响的具体浓度。

1

GB/T18420.2—2009

5采样、送样和样品保存

5.1样品的采集

5.1.1采样数量

采样量:钻井液5L,基液5L,生产水5L；采样量应足够供3次重复试验的用量。

5.1.2采样地点

5.1.2.1钻井液样品从排放口或泥浆池采集。

5.1.2.2基液样品采自贮存基液。

5.1.2.3生产水在排放点的排放口采样。

5.2包装、运输和贮存

5.2.1包装

采送样品应用惰性材料制成的容器密封包装，如聚乙烯塑料桶。

5.2.2运输

按照GB1737&3的规定贮存和运输样品，受检样品应在48h内送达生物毒性实验室。

5.2.3标签

所有样品容器上应标明样品名称、钻井代号、油井代号、生产或使用者、采样人、采样吋间、采样方

式、采样数量等。

样品送达实验室后送样人应填写送样表，样品接受人应检查样品标签和包装是否完整，并对样品进

行编号、签字和记录存档。

5.2.4贮存

生产水样品应贮存于4C〜8C,其他样品应贮存在阴凉处。

6实验生物

6.1实验生物的种类

6.1.1仔虾：中国明对虾CFenneropenaeuschinensis)y斑节对虾(Penaeusmonodon)、长毛明对虾(Fe”-

neropenaeuspenicillatus')、脊尾白虾(Palaemoncarincauda)、凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)五种

虾的仔虾。

6.1.2卤虫｛Artemia')

6.1.3蒙古裸腹(Moinamongolica)

6.1.4裸项栉虾虎鱼(Cteno^obius^ymnauchen)

6.2实验生物来源及品质

6.2.1仔虾

仔虾宜实验室自繁饲养，也可自货源稳定、信誉好的苗种场购买。仔虾购入后应在实验室驯养48h

后用于毒性试验，自繁饲养的仔虾应驯化24h后用于毒性试验。应选活力好，体色透明的仔虾用于

试验。

6.2.2卤虫

可实验室自繁收集卤虫，也可购买商品卵孵化：按1.0g/L的比例取适量卤虫卵加入稀释水中，在

25°C、盐度30〜35、光照2000lx〜3000lx的环境条件下充氧孵化。应取同一批次孵出的无节幼体用

于毒性试验。

6.2.3蒙古裸腹;蚤

宜实验室自繁收集。

6.2.4裸项栉虾虎鱼

宜实验室自繁收集。

2

GB/T18420.2—2009

6.3实验生物饲养条件

6.3.1仔虾

仔虾饲养的适宜条件见表1。

表1仔虾实验室饲养条件

饲养条件中国明对虾仔虾斑节对虾仔虾长毛明对虾仔虾脊尾白虾仔虾凡纳滨对虾仔虾

水温/C22〜2527〜2926〜2924〜2823〜30

盐度25〜3328〜3325〜3022〜288〜28

川7.6〜&27.6〜&27.6〜&27.9〜&6&0〜&3

6.3.2卤虫

在水温22°C〜27°C、盐度30-35、自然光照的条件下培养，每天投喂盐藻、扁藻或小球藻等单

胞藻。

6.3.3蒙古裸腹潯

在水温22°C〜27°C、盐度26〜30、自然光照的条件下培养，每天投喂盐藻、扁藻或小球藻等单

胞藻。

6.3.4裸项栉虾虎鱼

实验前1周采收受精卵并置于水温27°C〜28C、盐度25〜32、pH7.6〜&2条件下充气孵化，收

集初孵仔鱼并记录孵出日期，同一批收集的仔鱼孵出吋间间隔不能超过24h。仔鱼的饲养条件为水温

25°C~30C、盐度20〜30,自然光照，2日龄投喂轮虫，15日龄后可投喂卤虫幼体或轮虫。

6.4实验生物开始试验的日龄和观测指标

6.4.1仔虾:小于仔虾期10d(P“期)的仔虾，以死亡做观测指标。

6.4.2卤虫：卤虫卵孵化20h〜24h的幼体，以死亡或生长做观测指标。

6.4.3蒙古裸腹潼：I龄幼体，以死亡做观测指标。

6.4.4裸项栉虾虎鱼：3日〜10日龄的仔鱼，以死亡做观测指标。

6.5实验生物的质量控制

6.5.1实验生物应健康正常，驯养阶段的死亡率应小于10%。

6.5.2应进行标准毒物对实验生物的24h急性毒性试验，建立各批次实验生物的24hLG。范围，本试

验所用标准毒物为分析纯的十二烷基硫酸钠(sodiumdodecylsulfate,SDS)o

7设施和设备

7.1设施

7.1.1饲养实验生物的水池或水族箱等。

7.1.2可控照明装置。

7.1.3饲养实验生物的控温、充氧、循环清洁海水的设备,包括制冷和加热的控温设备、充气设备、循环

水设备、水过滤设备等。

7.2试验容器及溶液体积

7.2.1仔虾试验溶液体积应为1000niL,试验容器可采用玻璃水槽等玻璃容器。

7.2.2卤虫无节幼体试验溶液体积应为100mL,试验容器可采用烧杯等玻璃容器。

7.2.3蒙古裸腹淺试验溶液体积应为100mL,试验容器可采用烧杯等玻璃容器。

7.2.4裸项栉虾虎鱼仔鱼试验溶液体积应为200mL,试验容器可采用烧杯、水槽等玻璃容器。

7.3环境因子测定的试剂和仪器

溶氧仪、盐度计、pH计、温度计。也可采用分光光度法测定溶解氧含量，测定的试剂和仪器应符合

GB1737&4—2007第32章的规定。

3

GB/T18420.2—2009

7.4其他

高速搅拌器、显微镜、胶头滴管、量筒、手抄网、酶标板或者小离心管等。

8试验程序

&1检验样品的准备

&1.1稀释水的准备

稀释水应清洁、无毒、水质稳定且对实验生物适宜，宜使用取自清洁无污染海区水质稳定的海水作

为稀释水。若条件不许可，可使用人工配制海水，配制成与纳污水体相同的盐度后使用。

&1.2贮备液的配制

&1.2.1钻井液贮备液的配制

&1.2.1.1水基钻井液

按体积比取1份钻井液加入9份稀释水，2000r/min〜3000r/miri搅拌15min,然后加水稀释为

试验组的最高浓度，继续搅拌5min,静置60min后取上层悬浮液作为贮备液。

&1.2.1.2油基钻井液

按体积比取1份钻井液加入9份稀释水,2000r/min〜3000r/min搅拌15h至絮状，然后加水稀

释为试验组的最高浓度，继续搅拌5min,静置60min后，避开表面油膜，取水相部分作为贮备液。

&1.2.1.3合成基钻井液

按8.1.21.2的规定配制。

&1.2.2基液贮备液的配制

按8.1.21.2的规定配制。

&1.2.3生产水贮备液的配制

取一定体积的生产水加入稀释水中，2000r/min搅拌15min,配制成预定浓度的贮备液。

&2组织固定液的配制

&2.1固定液的使用

固定液用于以生长做观测指标的生物毒性试验中生物个体的组织固定。固定液可采用中性甲醛固

定液（3%〜5%）或鲁哥氏液。

&2.2中性甲醛固定液（3%〜5%）

以pH7.2-7.4的磷酸缓冲液为溶剂配制，配制后应密封并保存在阴凉处，保存时间不超过一个

月。3%中性甲醛固定液配方:蒸懈水925mL,加入无水磷酸氢二钠6.5g,及磷酸二氢钠4.0g,充分溶

解后加入甲醛（40%）溶液75mLo5%中性甲醛固定液配方：蒸憎水875mL,加入无水磷酸氢二钠

6.5g,及磷酸二氢钠4.0g,充分溶解后加入甲醛（40%）溶液125mLo

&2.3鲁哥氏液

鲁哥氏液又称碘液，配制方法：取6g碘化钾溶于20inL蒸懈水中，搅拌到完全溶解后，加入4g

碘，等碘充分溶解后，加入80mL蒸惘水，贮存在棕色试剂瓶内。

&3预备试验

宜选用2种或2种以上的实验生物进行试验。以死亡率为观测指标的预试验应尽量确定出全部死

亡和无死亡的浓度范围，以生长为观测指标的预试验应确定出能引起50%以上（低于100%）作用效果

和50%以下（高于0%）作用效果的浓度范围。具体操作按照&4。

&4正式试验

&4.1试验浓度设置

用贮备液和稀释水配制试验溶液,参考预试验结果设定5个等比浓度组和1个空白对照组，等比系

数不宜大于2.0,每个试验组应设4个重复，每个容器应放10个实验生物个体。如果样品毒性较低，则

应保证试验死亡数据至少能满足计算LG。或ECg的最低要求。

4

GB/T18420.2—2009

&4.2实验生物移入

&4.2.1仔虾

用手抄网在驯养池中随机选择实验生物并及吋放入试验容器内。弃用跃出或损伤的生物。在试验

操作过程中，应在30min内完成分放实验生物。

&4.2.2卤虫

用胶头滴管在驯养容器随机吸取卤虫幼体，然后小心移入试验容器。尽量减少分放实验生物的吋

间，尽量减少生物移入过程中对各浓度组试验溶液的稀释。

&4.2.3蒙古裸腹j蚤

按照&4.2.2规定的方法操作。

&4.2.4裸项栉虾虎鱼仔鱼

按照&4.2.2规定的方法操作。

&4.3充气要求

当试验溶液的溶解氧饱和度低于60%时，应对试验溶液进行轻微充气，充气气泡为60个/min〜

100个/min。如浓度组进行充气，同样对照组也应充气。

&4.4试验的环境因子

试验适宜的环境条件为：水温23C〜28°C,盐度20-35,PH7.6〜&6。试验过程中水温变化范围

不应超过2C,盐度变化范围不宜超过2,pH值变化范围不宜超过0.4。

&4.5饲喂

&4.5.1仔虾宜饲喂卤虫无节幼体，每个仔虾每天饲喂10个卤虫无节幼体。

&4.5.2卤虫幼体和蒙古裸腹淺饲喂扁藻、小球藻等单细胞藻类，藻液离心后饲喂（离心转数

3000r/min〜4000r/min）,避免加入藻液引起试验溶液体积的明显改变。

&4.5.3裸项栉虾虎鱼仔鱼宜饲喂轮虫，每条仔鱼每天投喂500个轮虫，每个试验容器投喂体积不超

过0.2mL„

&4.6观察和记录

&4.6.1仔虾

毒性试验持续吋间为96h,每24h观察实验生物，移去死亡个体，将死亡个体数记录在原始记录表

内，见表A.1。轻触无反应或在体视显微镜下观测心脏停止跳动均可判定为死亡。

&4.6.2卤虫

&4.6.2.1以死亡为观测指标的毒性试验，持续时间为96h,每24h观察实验生物，移去死亡个体，将

死亡个体数记录在原始记录表内，见表A.1。沉到容器底部的幼体在15s内仍不能游动者，即认为已

死亡。

&4.6.2.2以生长为观测指标的毒性试验，持续吋间为72h。72h时用吸管吸出存活个体置于酶标

板或离心管中，加入鲁哥氏液或中性甲醛固定液（3%〜5%）固定后，吸出卤虫置载玻片上，在4倍物镜

下用目镜测微尺观测体长，或使用显微镜摄像系统的软件进行体长测量，卤虫体长为尾凹到头部的最长

距离。将体长观测值记录在原始记录表内，见表A.2。

&4.6.3蒙古裸腹j蚤

毒性试验持续吋间为72h,每24h观察实验生物，移去死亡个体，将死亡个体数记录在原始记录表

内，见表A.1。沉到容器底部的蒙古裸腹潼在15s内仍不能游动者，即认为已死亡。

&4.6.4裸项栉虾虎鱼仔鱼

毒性试验持续吋间为96h,每24h观察实验生物，移去死亡个体，将死亡个体数记录在原始记录表

内，见表A.1。体色不透明或身体弯曲，且用胶头滴管轻吹无反应的判为死亡个体。

&4.6.5环境因子的测定和记录

每次试验溶液配制后应测定并记录各项环境因子，如溶解氧、pH值、水温、盐度等，结束试验吋宜

5

GB/T18420.2—2009

相应地测定并记录这些环境因子。测定值记录在原始记录表上，参见附录A。

9试验结果分析和判断

9.1结果的有效性

试验溶液的溶解氧饱和度应达到60%以上。以卤虫作为实验生物的试验，对照组的死亡率不超过

10%;以仔虾及仔鱼作为实验生物的试验，对照组的死亡率不超过20%。

9.2试验结果的判定

9.2.1试验结果判定流程

试验结果判定流程见附录B。

9.2.2以死亡为观测指标的生物毒性试验

9.2.2.1在大于或等于生物毒性容许值的试验浓度组未出现实验生物死亡，直接判定为大于生物毒性

容许值。

9.2.2.2当小于生物毒性容许值的试验浓度组出现实验生物死亡，通过概率单位法、图表法等方法计

算LC50值。概率单位法＞Spearman-karber法和TrimmedSpearman-karber法计算LC50值和置信区间，

作为受检物的生物毒性结果，计算方法参见附录C和附录Do

9.2.2.3在小于生物毒性容许值的试验浓度组出现实验生物死亡，通过计算NOEC值辅助判定受

物的生物毒性。对试验结果进行正态分布和方差齐次检验，参见附录E,如符合正态检验和方差齐次

验则采用附录F的参数检验方法（Dunnett's检验）判定NOEC值。如不符合正态检验或方差齐次检验

则采用附录F的非参数秩检验方法（Sleeps多对一检验）判定NOEC值。

9.2.3以生长为观测指标的生物毒性试验

通过线性内插法计算ECm,以EG。值作为受检物的生物毒性结果，计算方法参见附录C；可以通过

计算NOEC值来辅助判定受检物的生物毒性，按9.2.2.3规定的方法计算。

10质量控制

10.1批间和批内质量控制

10.1.1每批次试验必须同吋进行标准毒物的24h生物毒性试验，通过比较LGo值评价实验生物质量

的稳定性。

10.1.2保证试验过程试验环境因子的稳定性，即试验期间的水温变化不应超过2C,盐度变化不宜超

过2,pH变化范围不应超过0.4,溶解氧饱和度应大于60%。

10.2原始记录

原始记录应完整，包括采样的吋间和地点、试验时间、样品的保存方法、采样和试验人员签名、试验

所用的方法和技术、质量控制记录、试验的原始资料、仪器校准和维修记录、试验报告等。

11检验报告

检验报告应包括检验报告表和试验报告。

检验报告表包括:送样单位、送样人、送样吋间、样品名称、样品编号、样品接受人、检验依据的标准、

试验结果、出具检验结果的生物毒性试验室签章等。生物毒性检验报告表的格式参见附录G。不同试

验的检验报告应分别撰写。

试验报告包括：受试样品表观描述；稀释水、贮备液和试验溶液的配制；试验所用仪器设备；实验生

物介绍；对照组和各个浓度组死亡数；用浓度反应曲线或方程表示的试验浓度与实验生物反应的关系；

检验人签名。

6

GB/T18420.2—2009

附录A

（资料性附录）

生物毒性试验结果原始记录表

表A.1为生物死亡毒性试验结果原始记录表。

表A.2为生物生长毒性试验结果原始记录表。

表A.172h/96h静水式生物死亡毒性试验原始记录表

受试物质：样品编号：送样单位：

实验生物：送样日期：试验日期：

检验依据：样品表观性状：

对照组组1•mg/L组2：mg/L

时间项目

ABCDABCDABCD

存活数

水温

'C

0h盐度

pH

DO

nig/L

存活数

水温

24h

'C

盐度

存活数

水温

48h

€

盐度

存活数

水温

72h

€

盐度

存活数

水温

€

96h盐度

pH

DO

nig/L

7

GB/T18420.2—2009

表A.1（续）

受试物质：样品编号：送样单位:

实验生物：送样日期：试验日期:

检验依据：样品表观性状：

组3：mg/L组4：mg/L组5:mg/L

时间项目

ABCDABCDABCI)

存活数

水温

'C

0h盐度

pH

DO

nig/L

存活数

水温

24h

'C

盐度

存活数

水温

48h

€

盐度

存活数

水温

72h

€

盐度

存活数

水温

€

96h盐度

pH

DO

nig/L

检测人：复核人:

8

GB/T18420.2—2009

表A.272h生物生长毒性试验原始记录表

受试物质：样品编号：送样单位：

实验生物：送样日期：试验日期：

检验依据：样品表观性状：

对照组试验组1:mg/L试验组2：mg/L

时间项目

ABCDABCDABCI)

水温

'C

盐度

0h

pH

DO

mg/L

水温

'C

24h

盐度

水温

'C

48h

盐度

水温

'C

盐度

pH

DO

nig/L

1

2

72h

3

4

体长5

mm6

7

8

9

10

9

GB/T18420.2—2009