DB45/T 1510-2017 PRRSV美洲型经典株、变异株及欧洲型毒株的检测 多重反转录聚合酶链反应法

ICS11.220

B4141B

DB45

广西壮族自治区地方标准

DBDB1510—201745/T

PRRSV美洲型经典株、变异株及欧洲型毒株

的检测多重反转录聚合酶链反应法多重反转录聚合酶链反应法的检测

MultiplexRT-PCRfordetectionofclassicalandvariantstrainsofNorthAmericanAmericanNorthofstrainsvariantandclassicalofdetectionforRT-PCRMultiplex

genotypeandEuropeangenotypeporcinereproductiveandrespiratorysyndromesyndromerespiratoryandreproductiveporcinegenotypeEuropeanandgenotype

virusvirus

2017-04-15发布2017-05-15实施

广西壮族自治区质量技术监督局发布

DB45/T1510DB45/T—2017

目目次

前言................................................................................II................................................................................前言

11..............................................................................范围

21........................................................................术语和定义

32..................................................................试剂、仪器及耗材

43..........................................................................检测方法

54..........................................................................结果判定

附录A（资料性附录）引物序列、扩增片段及凝胶电泳图6..................................

附录B（资料性附录）试剂盒9..........................................................

附录C（资料性附录）重组质粒标准品制备11.............................................

I

DB45/T1510DB45/T—2017

II

DB45/T1510DB45/T—2017

前前言

本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。1.1—2009给出的规则起草。本标准按照GB/T

请注意本标准的某些内容可能涉及专利。本标准的发布机构不承担识别这些专利的责任。

本标准由广西壮族自治区水产畜牧兽医局提出并归口。

本标准起草单位：广西壮族自治区动物疫病预防控制中心。

本标准主要起草人：施开创、蒙振亩、张步娴、莫胜兰、王海清、尹彦文、韦建华、胡杰、李军。

III

DB45/T1510DB45/T—2017

PRRSV美洲型经典株、变异株及欧洲多重反转录聚型毒株的检测

合酶链反应法合酶链反应法

11范围

本标准规定了用于鉴别检测猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型经典株、变异株及欧洲型毒株的多重反

转录聚合酶链反应法的术语和定义、试剂、仪器及耗材、检测方法及结果判定。

本标准适用于猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型经典株、变异株及欧洲型毒株的检测。

22术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

2.12.1

猪繁殖与呼吸综合征病毒porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSVvirus，PRRSVsyndromerespiratoryandreproductiveporcine猪繁殖与呼吸综合征病毒

又称猪蓝耳病病毒，属于动脉炎病毒科动脉炎病毒属，其基因组为单股正链RNA。又称猪蓝耳病病毒，属于动脉炎病毒科动脉炎病毒属，其基因组为单股正链RNA。

2.22.2

猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型经典株classicalporcinereproductiveandrespiratoryrespiratoryandreproductiveporcineclassical猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型经典株

syndromevirus，C-PRRSVvirus，C-PRRSVsyndrome

指在病毒Nsp2蛋白第481位和第533∼561位氨基酸未出现缺失的、以VR-2332株为代表的美洲基因型

猪繁殖与呼吸综合征病毒。

2.32.3

猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型变异株highlypathogenicporcinereproductiveandandreproductiveporcinepathogenichighly猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型变异株

respiratorysyndromevirus，HP-PRRSVvirus，HP-PRRSVsyndromerespiratory

指在病毒Nsp2蛋白第481位和第533∼561位氨基酸出现30个氨基酸的不连续缺失为特征的、以JXA1

株为代表的高致病性美洲基因型猪繁殖与呼吸综合征病毒。

2.42.4

猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型毒株EuropeangenotypeporcinereproductiveandandreproductiveporcinegenotypeEuropean猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型毒株

respiratorysyndromevirus，EU-PRRSVvirus，EU-PRRSVsyndromerespiratory

指以Lelystad指以Lelystadvirus(LV)株为代表的欧洲基因型猪繁殖与呼吸综合征病毒。该型毒株最早在欧洲

分离得到。

2.52.5

反转录reversetranscription，RTtranscription，RTreverse反转录

模板以RNA为合成互补脱氧核糖核酸（cDNA）的过程。

1

DB45/T1510DB45/T—2017

2.62.6

聚合酶链反应polymerasechainreaction，PCRreaction，PCRchainpolymerase聚合酶链反应

是一种由热变性→复性→延伸三步反应组成一个循环多，经次循环反应，在体外快速扩增特定脱氧

核糖核酸（DNA）片段的方法。

2.72.7

多重聚合酶链反应multiplexpolymerasechainreaction，Multi-PCRreaction，Multi-PCRchainpolymerasemultiplex多重聚合酶链反应

简称多重PCR，是PCR技术的一种特殊形式在。指同一反应体系中加入多对引物，同时扩增多个模板

的PCR技术。

33试剂、仪器及耗材

3.13.1试剂

3.1.13.1.1特异性引物

引物序列见附录A中的表A.1，上、下游引物的使用浓度均为25pmol/µL。

3.1.23.1.2RNA抽提试剂盒

商业化的RNA提取试剂盒主要成分见附录B中的B.1，使用前按使用说明书经技术验证合格。

3.1.33.1.3RT-PCR试剂盒

商业化的RT-PCR试剂盒主要成分见附录B中的B.2，使用前按使用说明书经技术验证合格。

3.1.43.1.4电泳缓冲液

商业化的电泳缓冲液主要成分见附录B中的B.3，使用前按使用说明书经技术验证合格。

3.1.53.1.5胶回收试剂盒

商业化的胶回收试剂盒主要成分见附录B中的B.4，使用前按使用说明书经技术验证合格。

3.1.63.1.6T4连接酶试剂盒

商业化的T4连接酶试剂盒主要成分见附录B中的B.5，使用前按使用说明书经技术验证合格。

3.1.73.1.7质粒提取试剂盒

商业化的质粒提取试剂盒主要成分见附录B中的B.6，使用前按使用说明书经技术验证合格。

3.23.2仪器

本方法使用下列仪器：

——生物安全柜；

——普通PCR仪；

——高速台式冷冻离心机；

——电热恒温水槽；

——混匀器；

——组织匀浆机；

2

DB45/T1510DB45/T—2017

——凝胶成像系统；

——微量移液器。

3.33.3耗材

一次性耗材如下：

——乳胶手套；

——离心管；

——PCR反应管；

——吸头。

注：离心管、PCR反应管、吸头等应使用无RNA酶的一次性塑料制品。

44检测方法

4.14.1检测环境

在生物安全II级或II级以上防护实验室内、无RNA酶的环境下进行。

4.24.2待检样品处理

采取病猪的肺脏、脾脏和淋巴结等组织共约1g，置于2.0mL离心管中，加入灭菌的1mol/LPBSH（p

7.2）1mL，用组织匀浆机充分研磨后，反复冻融3次；细胞培养物则直接反复冻融3次。以10000×g

离心5min，收集上清，用于总RNA提取，或置-20℃保存备用。

血清样品直接用于总RNA提取，或置-20℃保存备用。

4.34.3待检样品总RNA提取

取200µL待检样品于无RNA酶的1.5mL离取试剂盒心管中，按照RNA提操作说明书提取总RN