GB/T 28073-2011 南芥菜花叶病毒检疫鉴定方法

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中华人民共和国国彖标准

GB/T28073—2011

南芥菜花叶病毒检疫鉴定方法

Detectionandidentificationofarabismosaicvirus

2011-12-30发布2012-06-01实施

GB/T28073—2011

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本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。

本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。

本标准起草单位：中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中华人民共和国上海出入境检验检疫

局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国福建出入境检验检疫局。

本标准主要起草人:廖富荣、于翠、张永江、陈红运、林石明、陈青、黄蓬英、沈建国、吴媛。

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GB/T28073—2011

南芥菜花叶病毒检疫鉴定方法

1范围

本标准规定了南芥菜花叶病毒血清学和分子生物学的检测鉴定方法。

本标准适用于植物种子、鳞球茎、苗木和组培苗等植物及其产品中南芥菜花叶病毒的检测与鉴定。

2南芥菜花叶病毒基本信息

中文名：南芥菜花叶病毒。

英文名:arabismosaicviruso

异名:arabismosaicncpovirus；hopnettlehcadvirus啤酒花尊麻病病毒）;rhubarbmosaicvirus大

黄花叶病毒）;raspberryyellowdwarfvirus悬钩子黄矮病毒）;ashringandlinepatternviurs白腊树

环线状病毒）；rhabarber-mosaik-virus大黄花叶病毒）;forsythiayellownetvirus连翘黄网状病毒）；

jasmineyellowblotchvirus茉莉黄斑病毒）＜

英文缩写:ArMVo

属豆工豆花叶病毒科Comoviridae,线虫传多面体病毒属Nepovirusa

南芥菜花叶病毒的其他信息参见附录A。

3方法原理

利用基于抗原抗体反应的双抗夹心酶联免疫吸附测定DAS-ELISA）,反转录和体外DNA扩增技

术的反转录聚合酶链式反应RT-PCR）进行检测鉴定。

4主要仪器设备

本标准的检测鉴定方法主要使用以下仪器设备：

微量榨汁机、酶标仪、洗板机、微量天平（感量：0.001g）、PCR仪、荧光PCR仪、电泳仪、水平电泳

槽、凝胶成像仪、高速冷冻台式离心机、水浴槽、pH计等和各种量程的可调移液器（1000#L、200卩L、

100pL、20ptL、10piL、2yL）°

5检测与鉴定

5.1DAS-ELISA检测

把0.5g〜1.0g样品充分研磨或在液氮中研磨，按1:10比例加入样品提取缓冲液，转移到5mL

离心管中，8000r/min离心5min,上清液作为DAS-ELISA的检测提取液。

设置阴性对照、阳性对照和空白对照，阴性对照的种类和材料（如：种子或叶片）应该尽量与所检测

样品类型相一致。具体操作过程见附录B。

注：提取液在3h内使用，否则保存在4°C中。

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GB/T28073—2011

5.2RT-PCR检测

分别提取检测样品的总RNA,然后用RT-PCR检测。用健康的植物组织作阴性对照，用感染

ArMV的植物组织作阳性对照，用超纯水作空白对照。

具体操作过程见附录C。

5.3实时荧光RT-PCR检测

分别提取检测样品的总RNA,反转录合成cDNA后用实时荧光PCR检测。用健康的植物组织作

阴性对照,用感染ArMV的植物组织作阳性对照，用超纯水作空白对照。

具体操作过程见附录D。

5.4序列测定

将PCR产物回收后，进行克隆、测序，或者直接测序，测序可由生物公司完成。把测序所得到的核

昔酸序列与已知的ArMV相应序列进行比对，如果翻译后氨基酸序列与已知的ArMV相应序列同源

性大于75%则判定为ArMV序列，小于75%则判定为非ArMV序列。

注：序列比对可利用NCBI网站上的BLAST软件进行，网址为htlp：//www.ncbi.nlrn.nih.gov/BLAST./

6结果判定与报告

6.1结果判定

当产生以下检测结果时,则判定为检出ArMV：

一当DAS-ELISA检测.RT-PCR检测、实时荧光RT-PCR检测，其中有两种方法检测结果呈阳

性时，判定为检出ArMV；

——当RT-PCR检测结果呈阳性，测定的序列为ArMV序列，则判定为检出ArMV。

6.2结果记录与保存

记录各项实验数据,包括样品种类、来源，检测时间、地点、方法和结果等。血清学检测结果保存吸

光值的数据报告,RT-PCR检测结果保存电泳照片，实时荧光RT-PCR检测结果保存采集的数据，序列

测定结果保存测序报告图。

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附录A

(资料性附录)

南芥菜花叶病毒简介

A.1分布

欧洲：奥地利、白俄罗斯、比利时、保加利亚、塞浦路斯、捷克共和国、丹麦、芬兰、法国、德国、匈牙利、

爱尔兰、意大利、拉脱维亚、立陶宛、卢森堡公国、摩尔多瓦、荷兰、挪威、波兰、罗马尼亚、俄罗斯、斯洛伐

克、斯洛文尼亚、瑞典、瑞士、英国、乌克兰和南斯拉夫。

亚洲：日本、哈萨克斯坦、土耳其、伊朗。

非洲：南非。

北美洲：加拿大、美国。

大洋洲：澳大利亚、新西兰。

A.2形态特征

该病毒属线虫传多面体病毒，病毒粒体为等轴对称二十面体,直径约30nm,为双分体病毒，含有

两条相对分子质量分别为2.4X10"和1.4X1