DB33/T 2287-2020 罗氏沼虾双顺反子病毒-1 检测规程

ICS65.020.30

CCSB41

DB33

浙江省地方标准

DB33/T2287—2020

罗氏沼虾双顺反子病毒-1检测规程

DetectionprotocolsforMacrobrachiumrosenbergiidicistrovirus-1

2020-11-30发布2020-12-30实施

浙江省市场监督管理局发布

DB33/T2287—2020

前言

本标准按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》给出的规

则起草。

本标准由浙江省农业农村厅提出。

本标准件由浙江省水产标准化技术委员会归口。

本标准起草单位：浙江省淡水水产研究所。

本标准主要起草人：潘晓艺、沈锦玉、蔺凌云、姚嘉赟、尹文林、曹铮、刘忆瀚、夏炎春。

I

DB33/T2287—2020

引言

本标准的发布机构提请注意如下事实，声明符合本标准时，可能涉及到6.10-6.11中引物与《罗氏

沼虾双顺反子病毒全基因组序列及其应用》(专利号：201110296487.9)专利权的使用。

本标准的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场。

该专利持有人已向本标准的发布机构保证，他愿意同任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下，

就专利授权许可进行谈判。该专利持有人的声明已在本标准的发布机构备案。相关信息可以通过以下联

系方式获得：

专利持有人：浙江省淡水水产研究所

地址：浙江省湖州市吴兴区杭长桥南路999号

请注意除上述专利外，本标准的某些内容仍可能涉及专利。本标准的发布机构不承担识别这些专利

的责任。

II

DB33/T2287—2020

罗氏沼虾双顺反子病毒-1检测规程

1范围

本标准确立了罗氏沼虾双顺反子病毒-1的检测程序，规定了术语与定义、缩略语、罗氏沼虾双顺反

子病毒-1检测程序的构成、试剂和材料、器材与设备、操作步骤和结果判定。

本标准适用于罗氏沼虾双顺反子病毒-1的检测及关联疾病的流行病学调查、诊断和监测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法

GB19489实验室生物安全通用要求

SC/T7103水生动物产地检疫采样技术规范

SC/T7202.1斑节对虾杆状病毒病诊断规程第1部分：压片显微镜检查法

3术语与定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

罗氏沼虾双顺反子病毒-1Macrobrachiumrosenbergiidicistrovirus-1

罗氏沼虾幼体死亡综合征的主要病毒性病原，又称为罗氏沼虾太湖病毒（Macrobrachiumrosenbergii

taihuvirus，MrTV），属于小RNA病毒目、双顺反子病毒科、急麻病毒属，病毒粒子为无囊膜的直径约

30nm的二十面体球形颗粒，核酸类型为单股正链RNA，长度约10.3kb。其主要侵染罗氏沼虾幼体甲壳

下上皮组织和神经节，造成肝脏和结缔组织出现强嗜碱性细胞质包涵体。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

bp：碱基对（Basepair）

DEPC：焦乙酸二乙酯（Diethylpyrocarbonate）

DNA：脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleicacid）

dATP：脱氧腺苷三磷酸（Deoxyadenosinetriphosphate）

dCTP：脱氧胞苷三磷酸（Deoxycytidinetriphosphate）

dGTP：脱氧鸟苷三磷酸（Deoxyguanosinetriphosphate）

dNTP：脱氧核苷三磷酸（Deoxyribonucleosidetriphosphate）

1

DB33/T2287—2020

dTTP：脱氧胸苷三磷酸（Deoxythymidinetriphosphate）

EB：溴化乙啶，核酸染色剂（Ethidiumbromide）

MrDV-1:罗氏沼虾双顺反子病毒-1（Macrobrachiumrosenbergiidicistrovirus-1）

MrTV：罗氏沼虾太湖病毒（Macrobrachiumrosenbergiitaihuvirus）

M-MLV：莫洛尼鼠白血病病毒（Moloneymurineleukemiavirus）

RdRp：RNA依赖的RNA聚合酶（RNA-dependentRNApolymerase）

RNA：核糖核酸（Ribonucleicacid）

RNasin：核糖核酸酶抑制剂（RNaseinhibitor）

RT-PCR：逆转录-聚合酶链式反应（Reversetranscriptionpolymerasechainreaction）

Taq：水生噬热杆菌（Thermusaquaticus）

5罗氏沼虾双顺反子病毒-1检测程序的构成

罗氏沼虾双顺反子病毒-1检测程序包括5个阶段，其中RT-PCR操作阶段又分3个步骤。程序流程图

见图1。

图1罗氏沼虾双顺反子病毒-1检测程序流程图

2

DB33/T2287—2020

6试剂和材料

6.1水：符合GB/T6682-2008中一级水的要求，核酸抽提和RT-PCR应使用无RNA酶的去离子水。

6.2dNTPs：含dATP、dTTP、dGTP、dCTP各10mmol/L的混合物，－20℃保存。

6.3RNA酶抑制剂：40U/L，－20℃保存，避免反复冻融或温度剧烈变化。

6.4M-MLV逆转录酶：200U/L，－20℃保存，避免反复冻融或温度剧烈变化。

6.55×M-MLV逆转录酶缓冲液：－20℃保存。

6.610×PCR缓冲液：－20℃保存。

6.7TaqDNA聚合酶：5U/L，－20℃保存，避免反复冻融或温度剧烈变化。

6.8DNA分子量标准：DNAMarkerDL2000，－20℃保存。

6.9琼脂糖：电泳级。

6.10RT-PCR外引物：

MrTV572F1：5’-ATGTA-GAGCG-TGGAG-GAGTA-AAA-3’，

MrTV572R1：5’-CACTA-TCTCT-GTCTT-CGAGG-GATT-3’，

扩增RdRp基因的572bp片段。

6.11RT-PCR内引物：

MrTV472F2：5’-TGCTT-CTATT-TCGGC-TCG-3’，

MrTV472R2：5’-CAACG-AATTA-