GB/T 16550-2020 新城疫诊断技术

ICS11.220

B41GB

中华人民共和国国家标准

GB/T16550-2020

0-

代替GB/T16552008

新城疫诊断技术

Diagnostictechniquesfornewcastledisease

2020-12-14发2020-12-14实

布施

国家市场监督管理总局申+

国家标准化管理委员会也叩

Gß/T16550-2020

前言

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。

，与GB/T16550-2008相比，主要技术变化

本标准代替GB/T16550-2008((新城疫诊断技术))

如下:

修改了血凝和血凝抑制试验判定结果(见7.3和7.4，2008年版的5.3和6.刀，

删除了毒力评价指标中MDT和IVPI(见2008年版的4.3和4.4);

增加了实时荧光RT-PCR检测方法(见第9章)。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。

本标准由中华人民共和国农业农村部提出。

本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(S;\C/TC181)归口。

本标准起草单位中国动物卫生与流行病学中心、扬州大学。

本标准主要起草人刘华富、王静静、于晓慧、吕艳、吴艳涛、胡顺林、郑东霞、赵云玲、刘文博、

刘秀梵、王志亮。

本标准所代替标准的历次版本发布情况为:

GB16550-1996、GB/T1日550-2008.

Gß/T16550-2020

寻|

新城疫(Newcastledisease，ND)是由新城疫病毒(Newcastlediseasevirus，NDV)强毒株感染禽类

引起的一种急性、烈性传染病，给世界养禽业造成巨大的经济损失。世界动物卫生组织(OIE)将新城疫

列为法定报告的动物疫病，我国农业农村部将其列为一类动物疫病。

新城疫病毒可感染240多种禽类，其中家鸡和珠鸡最易感，感染禽(野鸟)及带毒禽(野鸟)系主要的

传染源。新城疫病毒主要经消化道和呼吸道传播，被污染的水、饲料、蛋托(箱)、种蛋、鸡胚和带毒的野

生飞禽、昆虫及有关人员等均可成为传播媒介。

新城疫病毒属于副黯病毒科(Paramyxoviridae)、正禽腮腺炎病毒属(Orthoavulavirus)，目前新城

疫病毒只有一种血清型，但可分为多种基因型。OIE规定，新城疫是由新城疫病毒强毒株引起的禽类

感染，因此，对于新城疫的诊断，除了鉴定新城疫病毒之外，还需要对其致病性进行评估。对于致病性评

估的方法，可通过1日龄SPF鸡ICPI进行视定，也可通过分子生物学技术，如RT-PCR结合序列测定

nt�420nt)差异，可将新城疫病毒分为Class1和Class11两

等。根据新城疫病毒F基因部分序列(47

大类，其中Class1在国内均系弱毒株，因此，针对Class1NDV的检测方法不具有诊断意义，本标准所

涉及的诊断方法均针对Class11新城疫强毒株。

U

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新城疫诊断技术

1范围

本标准规定了新城疫的临床诊断、病毒分离与鉴定、血凝和血凝抑制试验、反转录聚合酶链式反应

(RT-PCR)和实时荧光RT-PCR(Real-timeRT-PCR)的技术要求。

本标准适用于新城疫的诊断、检疫、检测、监测和流行病学调查等。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

GB19489实验室生物安全通用要求

NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范

NY/T1948兽医实验室生物安全要求通则

3缩略语

下列缩略语适用于本文件。

Ct值:每个反应管内的荧光信号量达到设定的阔值所经历的循环次数(Cyclethreshold)

DEPC，焦碳酸二乙醋(Diethypyrocarbonate)

H;\血禹王(Hemagglutinin)

HI血凝抑制(Haemagglutinationinhibition)

ICPI脑内接种致病指数(lntracerebralpathogenicityindex)

ND，新城疫(Newcastledisease)

NDV，新城疫病毒(Newcastlediseasevirus)

PBS，磷酸盐缓冲液(Phosphatebufferedsaline)

RBC鸡红细胞悬液(Redbloodcell)

RN;\核糖核酸(Ribonucleicacid)

RT-PCR，反转录聚合酶链式反应(Reversetranscription-polym盯asechainreactio时

Real-timeRT-PCR，实时荧光RT-PCR(Real-timereversetranscription-polymerasechainreac

tion)

SPF，无特定病原体(Specificpathogenfree)

4临床诊断

4.1流行病学

4.1.1宿主范围广，鸡、火鸡、鹊辑、鸽、鹅等多种家禽及野禽均易感，鸭也可感染。

4.1.2传染源主要为感染禽(野鸟)及带毒禽(野鸟)，主要经消化道和呼吸道传播，被污染的水、饲料、

蛋托(箱)、种蛋、鸡胚和带毒的野生飞禽、昆虫及有关人员等均可成为主要的传播媒介。

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4.1.3该病无明显季节性，一年四季均可发生，春秋季多发。

4.2临床症状

4.2.1临床致病型

根据临床表现不同，临床致病型分为:

a)嗜内脏速发型:以消化道出血性病变为主要特征，死亡率高，

l升嗜神经速发型:以呼吸道和神经症状为主要特征，死亡率高，

c)中发型:以呼吸道和神经症状为主要特征，死亡率低，

d)缓发型以轻度或亚临床性呼吸道感染为主要特征，

时无症状肠道型以亚临床性肠道感染为主要特征。

4.2.2典型症状

当病鸡出现下列之一或全部临床症状时，可作为初步诊断的依据之一:

a)发病急、病死率高，

b)体温升高、精神沉郁、呼吸困难、食欲下降，

c)粪便稀薄，呈黄绿色或黄白色，

d)发病后期出现扭颈、翅膀麻痹、瘫痪等神经症状，

e)免疫禽群出现产蛋下降，蛋壳质量变差，产畸形蛋或异色蛋。

4.3剖检变化

当病鸡出现下列之一或全部剖检变化时，可作为初步诊断的依据之一

a)全身蒙

b)腺胃黯膜水肿，乳头和乳头间有出血点，

c)盲肠扁桃体肿大、出血、坏死，

d)十二指肠和直肠黯膜出血，泄殖腔黯膜出血，有的可见纤维素性坏死病变，

e)脑膜充血和出血，

f)鼻窦、喉头、气管满腹充血，偶有出血，肺可见淤血和水肿。

4.4鉴别诊断

家禽感染高致病性禽流感病毒后，临床表现和死亡率与新城疫(ND)类似。与ND相比，高致病性

禽流感以全身器官出血为特征，包括肿头，眼险周围浮肿，鸡冠和肉垂肿胀、发紫、出血和坏死，腿及爪

鳞片出血等。在临床实践中，很难依据临床症状和lfÙ检变化进行区分，应依靠实验室诊断进行鉴别。

4.5结果判定

当禽类符合4.1，且符合4.2、4.3之一的，可判定为疑似新城疫。

5样晶采集与处理

5.1总则

样品采集宜在发病初期、选择具有典型临床症状的家禽，可采集脑、肺脏、脾脏、肾、肠(包括内容

物)、肝和心脏等组织脏器，也可采集未见明显临床症状禽类的泄殖腔和口咽拭子样品进行实验室诊断。

采样过程中不得交叉污染，在田间采样应勤换一次性手套，每采集一个样品宜更换或消毒一次灭菌采样

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器具，尽量做到无菌采集。样品采集、处理、保存和运输应符合GB19489和NY/T541的要求。

5.2组织样晶采集

典型临床发病禽可无菌采集脑、肺、脾、肾、肠(包括内容物)、气管、肝、心等组织脏器，装入无菌采样

袋或其他灭菌容器并编号，在20"C冷冻保存。

5.3拭子样晶采集

采集活禽样品时可采集口咽和泄殖腔拭子。取口咽拭子时应将拭子深入喉头及上腾裂来回旋转

2次�3次，要求可见明显蒙古

于鸽、珍禽等体型较小的禽鸟，采样时需用适合的拭子，避免因拭子取样给禽类造成损伤。将采集后的

拭子放入盛有2.0mL的PBS(O.Olmol/L、pH7.0�7.4，含青霉素2000U/mL、链霉素2mg/mL、10%

甘油)的采样管中，编号。用于病毒分离的拭子样品于20"C冷冻保存，尽量避免反复冻融。

5.4血清样晶采集

无菌采集禽类的血液，每只2.0mL，用于新城疫抗体检测。无菌分离血清，装入2.0mL离心管中，

加盖密封后冷藏或冷冻保存。

5.5样晶运输

样品采集后置保温箱中，加入预冷的冰袋，密封，宜24h内送实验室。

5.6样晶处理

5.6.1生物安全措施

样品处理的生物安全措施按照GB19489和NY/T1948进行。

5.6.2组织样晶处理

用无菌的剪刀和银子剪取待检样品，置组织匀浆器充分研磨，置于含抗生素的PBS(O.OlmoL/L、

pH7.0�7.的中，制成浓度为10%�20%的悬浮液，冻融2次�3次，室温(20"C�25"C)静置1h�

2h，3000r/min离心5min，取上清液转入无菌的1.5mL离心管中，编号备用。

5.6.3拭子样晶处理

将采集的拭子样品在振荡器t充分混合后，将拭子中的液体充分挤压后弃去拭子，室温静置作用

30mi口，3000r/min离心5min，取上清液转入无菌的1.5mL离心管中，编号备用。

5.6.4样晶保存

处理好的样品在2"C�8"C条件下保存应不超过24h.若需长期保存，应放置于70"C冰箱中，

反复冻融不超过3次。

6病毒分离与鉴定

6.1主要仪器设备

6.1.1孵化器。

6.1.2冰箱(2"C�8"C、20"C、70"C不同温度)。