GB/T 31793-2015 油菜茎基溃疡病菌检疫鉴定方法

ICS65.020.010

B16

中华人民共和国国家标准

/—

GBT317932015

油菜茎基溃疡病菌检疫鉴定方法

()

DetectionandidentificationofLetoshaeriamaculansFuckelCes.etDeNot.

pp

2015-07-03发布2015-11-27实施

中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局

发布

中国国家标准化管理委员会

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GBT317932015

前言

本标准按照/—给出的规则起草。

GBT1.12009

本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(/)提出并归口。

SACTC271

:、。

本标准起草单位中国检验检疫科学研究院中华人民共和国上海出入境检验检疫局

:、、、。

本标准主要起草人吴品珊易建平周国梁杜洪忠

Ⅰ

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GBT317932015

油菜茎基溃疡病菌检疫鉴定方法

1范围

本标准规定了油菜茎基溃疡病菌的检疫鉴定方法。

本标准适用于油菜和油菜茎基溃疡病菌其他十字花科寄主种子和植株中油菜茎基溃疡病菌的检疫

和鉴定。

2仪器和用具

2.1仪器

()、、、、、、

电子天平感量0.01g生物显微镜体视显微镜高速冷冻离心机纯水仪超净工作台高压灭菌

、、、、、、、。

锅制冰机PCR仪凝胶成像系统电泳仪实时荧光PCR仪培养箱冰箱

2.2用具

、、、、、、、、、、、、、

烧杯三角瓶量筒培养皿酒精灯镊子剪刀解剖刀接种针载玻片盖玻片研钵移液器移

、、、。

液器吸头离心管液氮罐孔径和的网筛

2.5mm1.5mm

3试剂和培养基

3.1试剂

(),,,,,,,,,

1.0%次氯酸钠NaClO琼脂粉马铃薯葡萄糖乳酸琼脂糖无菌双蒸水液氮蛋白胨磷酸二

,,,,,,,,,,,,

氢钾硫酸镁链霉素新霉素五氯硝基苯氯四环素利福平Tris-HClMClHClEDTANaOH

g2

,,,,,(),(),(),(

NaOAcKClTrisCTABTAE无水乙醇ethanol苯酚phenol溴化乙锭EB三氯甲烷chloro-

),(),(),,,,

form异丙醇isoroanol异戊醇isoamlalcohol蛋白酶KTaDNA聚合酶dNTPDNA相对

ppyq

分子质量标准物,特异性引物和实时荧光特异性引物及探针。

PCRPCR

3.2培养基

(),()。。

马铃薯葡萄糖琼脂培养基PDA酸性马铃薯葡萄糖琼脂培养基APDA具体配方参见附录A

4检疫鉴定方法

4.1种子检测

,、、、、;

未带有种衣剂的种子解剖镜下挑取皱缩干瘪变色畸形残缺或有霉变的种子1~2带有种

gg

,,,,

衣剂的种子先用自来水浸泡洗去种衣剂或用纱布包裹浸泡搓洗种子自来水冲洗去种衣剂待风干后

,。

挑取异常种子做分离培养

,,

商用油菜籽样品取用孔径和的网筛过筛孔径筛上物多为豆荚和

1kg2.5mm1.5mm2.5mm

,。,

茎等植株残体孔径1.5mm筛下物多为碎屑和细小油菜籽筛上物和筛下物混匀后取1~2制

gg

,,,。

样进行PCR初检初检如果阳性再挑取异常种子做分离培养

1

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GBT317932015

4.2植株症状检查

、,、、,

检查植物的根茎和叶片等部位对茎部溃疡黑斑根部变色黑腐叶上有灰色斑点的植物取样送

。。

实验室做进一步检验油菜茎基溃疡病菌为害症状参见附录A

4.3分离培养

;,

种子样品用无菌水室温浸泡无菌水洗涤次后加入无菌水浸泡置于培

0.5h~1h320℃~25℃

;;,

养无菌水洗涤次后转入下冷冻处理过夜次氯酸钠消毒无菌水次洗涤后置

1d3-20℃1%10min3

,//;。

于培养基上粒皿粒皿下黑暗培养

APDA30~4020℃10d

、、,,,

取可疑症状的根茎叶的病健交界处剪成5mm×5mm小块1%的次氯酸钠溶液消毒5min无

,,,。

菌水冲洗次吸干水分置培养基上下黑暗培养

3APDA20℃10d

4.4形态学鉴定

,,

在培养基上从第天开始观察分离样品周围是否有菌丝产生挑出菌丝转接到培养基

APD3PDA

,,,

上20℃下黑暗纯化培养5d~7d后开始观察记录病菌的培养性状显微镜下观察记录分生孢子和分

生孢子器的形态和大小。

4.5分子生物学鉴定

4.5.1DNA提取

,,(

将制备的商用油菜籽初检样品用液氮研磨后取样0.1~0.2采用CTAB方法提取DNA参见

gg

附录B)。

,,,

将分离到的真菌菌丝收集放入1.5mL浸在液氮里的离心管中用塑料杵碾碎采用CTAB方法

()。

提取DNA参见附录B

4.5.2PCR检测

:()(

常规方法一特异性引物和

PCRLm35'-GCCCACCAATTGGATCCCCTA-3'Lm45'-AG

)。,/,/

GCGAGTCCCAAGTGGAACA-3'PCR反应总体积为30L包含10mmolLTris-HCl50mmolL

μ

(),/,、、、/,

KClH8.32.5mmolLMCldATPdGTPdCTPdTTP浓度均为100molL引物浓度各为

pg2μ

/,,。:;,

100nmolL2L模板DNA1.5UTaDNA聚合酶反应循环程序为94℃3min94℃30s67℃

μq

,,;。,

个循环最后取扩增产物与的上样缓冲液混匀在

30s72℃30s3572℃5min10L3L6×

μμ

,//,()

1.5%琼脂糖凝胶1×TAE缓冲液中4Vcm~6Vcm电泳30min溴化乙锭EB染色后在成像系统

中成像分析。

:()

常规方法二特异性引物和

PCRLmacF5'-CTTGCCCACCAATTGGATCCCCTA-3'LmacR

()。,/,

5'-GCAAAATGTGCTGCGCTCCAGG-3'PCR反应总体积为30L包含10mmolLTris-HCl

μ

/(),/,、、、/,

50mmolLKClH8.32.5mmolLMCldATPdGTPdCTPdTTP浓度均为100molL引物

pg2μ

/,,。:;

浓度各为100nmolL2L模板DNA1.5UTaDNA聚合酶反应循环程序为94℃3min94℃

μq

,,,;。

个循环最后取扩增产物与的上样缓冲液

30s63℃30s72℃40s3572℃5min10L3L6×