WS 195-2001 军团病诊断标准及处理原则

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前言

军团病(legionnairesdisease)是由军团菌属(legionela)、主要是嗜肺军团菌(legionelapneumophi!a)引起的一种细菌性呼吸道传染病。本病在全球普遍存在。我国已有小规模爆发及散发病例。由于军团菌肺炎与其他肺炎不易区别，且老年人容易受到侵犯，一旦患病，病情相当严重。如治疗不当，其病死率可高达15%-20%。为了对军团病患者提供可靠的诊断，进行合适的治疗，结合我国军团病防治工作现状特制定本标准。本标准附录A中A2,A3,A4,附录13中133,134,135,136及附录C的诊断方法为参考诊断方法。本标准由卫生部疾病控制司提出。本标准负责起草单位:中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所;参加起草单位，协和医院本标准主要起草人:万超群、朱元环.陆慰it.本标准由卫生部委托传染病防治监督管理办公室负责解释。

中华人民共和国卫生行业标准

军团病诊断标准及处理原则WS195--2001

Diagnosticcriteriaandprinciplesofmanagementoflegionnairesdisease

参照《中华人民共和国传染病防治法力及《中华人民共和国传染病防治法实施办法》制定本标准

，范围

本标准规定了军团病的诊断标准及处理原则。本标准适用于各级、各类型医疗保健、卫生防疫机构和人员对军团病病例的诊断和处理

2诊断原则

2.1应根据流行病学资料及临床表现和常规实验室检验结果进行综合分析。2.2确诊需依据病人双份血清军团菌抗体恢复期较急性期增高4倍或以上或军团菌培养阳性。

3诊断标准

3.1流行病学史全年均可发病，多数发生在夏秋季节。中老年病例较为多见。有慢性肺病病史者、免疫功能低下者、器官移植者、建筑工地施工人员、近两周内的旅行者以及吸烟者较易感。如发现两例或以上的成组病例，应当进行血清流行病学调查。同时对可疑军团病患者的标本，如痰、血液、胸水、支气管肺泡灌洗液进行军团菌的分离培养，还可从外环境如宾馆、医院、电影院等的空调系统冷却塔水、淋浴水、湖水、井水、池水以及地表面污水中分离军团菌3.2临床表现临床上可以有两种类型:非肺炎型印ontiacfever)和肺炎型。3.2.1非肺炎型临床表现类似感冒，症状:发热、咳嗽、头痛、肌痛和胸痛，但无肺炎。病程3?-10天可自愈。3.2.2肺炎型亚急性起病，症状:发热、头痛、寒颤、咳嗽或痰中带血，胸痛和肌痛，部分病人有恶心、呕吐、腹泻、相对缓脉，有些患者尤其是儿童，可出现精神神经症状如澹妄、幻觉甚至昏迷等，重症病人可发生急性肾功能衰竭、休克，或因菌血症产生的肺外器官感染。X线胸片显示肺有浸润性阴影，部分有胸腔积液，重症病人有肺脓肿甚至空洞。3.3常规实验室检查多数血沉加快，血白细胞计数增高，部分有中性白细胞核左移，可能有乳酸脱氢酶、血清谷草转氨酶、胆红素升高或有蛋白尿、低钠血症和低磷血症，血尿并不多见，但镜检时尿中可有红细胞。痰或气管内抽吸物作革兰染色和一般培养。军团菌为革兰阴性杆菌，但初代分离菌革兰染色着色不明显，而且培养的阳性率很低。3.4特异性实验室检查(参见附录A、附录B、附录C)3.4.1军团菌培养_____中华人民共和国卫生部2001-07-20批准2002-01-01实施

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以痰、支气管抽吸物、支气管肺泡灌洗液或胸水为标本，在含N-2一乙酞氨基-2-氨基乙烷磺酸(A('ES)的酵母浸膏培养基(BCYE)中培养军团菌。3.4.2细菌抗原检测采用直接荧光抗体法(DFA).3.4.3血清特异性抗体检测采用间接荧光抗体法(IFA),试管凝集试验(TA)等方法检测军团菌特异性抗体。起病时及:1-8周后两次血清军团菌抗体滴度呈4倍或以上增长，单次抗体大于1:256(1FA)，或凝集抗体从1:40呈d倍或以上增长或一次凝集滴度为1:320(TA)者，可确定有军团菌感染3.5病例分类3.5.1临床诊断满足3.1,3.2,3.3加3.4.23.5.2确诊病例满足3.1,3.2,3.3加3.4.1或3.4.2.

4处理原则(参见附录D)4.1、早期发现病人.早期治疗:对可疑病人应及时进行特异性实验室检查以明确诊断。确诊者可选用红阿奇霉素等或和利福平一并使用，复方新诺明、四环素、环丙沙星、强力霉素对部分病人有效应尽量避免使用糖类皮质激素。4.2早期发现并发症如急性肾功能衰竭、休克等应及时积极抢救。4.3如发现成组病例应向防疫部门报告‘，通过流行病学调查证实后，采取合适的防治措施，对被军团菌污染的水源，如建筑物中的空调系统冷却塔水、冷热水管道系统水进行细菌学检测，必要时进行消毒处理。对可疑者及易感人群选用红霉素、阿奇霉素等治疗。

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附录A(标准的附录)军团病病原学诊断方法

A1直接荧光抗体染色检查法

本法操作简便，能快速发现各种被检病理标本中是否存在军团菌。但当标本中军团菌数量较少或病原菌为荧光抗血清未包括的新种(型)时，结果常为阴性，故阴性结果不能排除军团病。Al.1荧光抗体制备A1.1.1用1%甲醛盐水自固体培养基上洗下军团菌菌苔,4C过夜杀菌,pH7.2操作PBS洗2次.配制成4X109/mL菌细胞的菌液A1.1.2免疫前自家兔取血，用作对照血清，采取皮内注射法或静脉注射法免疫家兔。如凝集反应效价达到1，5120以上可以全放血，并分离血清。Al.1.3免疫前兔血清与抗军团菌血清用50%.33%饱和度硫酸钱提取r-球蛋白.调整蛋白浓度为20mg/ml。按常法用异硫氰酸荧光素(FIT(;)标记。A1.2标本制备Al.2.1肺组织:新鲜组织可制成印片或研磨成1oY,悬液后涂膜.于空气中干燥后加热固定。再在涂膜上滴加10%中性甲醛固定10min。吸弃甲醛后用蒸馏水轻轻漂洗，干燥后镜检。如为甲醛固定组织，可用刀片切成组织块，造成新的组织面，用刀片呈直角在组织上刮取细微的组织颗粒糊，于载玻片L涂膜，干燥后加热固定。Al.2.2其他标本:痰、支气管灌洗液或抽出物、胸水(应注意抗凝)可选取粘性部分(胸水等也可离心取沉淀物)涂膜，干燥后加热固定。10%中性甲醛固定]10min,蒸馏水漂洗，干燥后染色镜检。可疑培养物:用接种环挑取可疑菌落.混悬于1%甲醛等渗盐水中，涂膜，干燥，加热固定。A1.3染色方法A1.3.1荧光抗体工作溶液配制:将标准军团菌株用PBS制成悬液后涂片，使每高倍视野菌数500-60。条，用不同稀释度的荧光抗体染色。凡出现3十~4+荧光强度的最高稀释度为1个效价单位(3+:菌细胞发明亮的黄绿色荧光;4+:菌细胞发耀眼的黄绿色荧光)。常规工作中用2个效价单位作为L作溶液。Al.3.2操作:每份标本在同一张载片上作两个涂膜。一个用免疫前兔r一球蛋白荧光素标记物染色.作阴性对照;另一用荧光抗体染色。置37C湿盒中温育30min后用PBS洗去多余的荧光血清(洗时载片加有荧光抗体的一侧向下)，并用PBS浸洗2次(每次5min),燕馏水冲洗1次，干燥，涂膜滴加pH9.0缓冲甘油，盖玻片封固，荧光显微镜检查。A1.4结果的解释:痰胸水、气管抽吸物或灌洗液等标本，每张涂膜上只要发现5条以上染色鲜明、形态典型的军团菌，即可报告阳性。其他临床标本，每张涂片发现有)25条强烈发荧光的细菌，报告为阳性,1?-24条为可疑，。条为阴性。

A2军团菌多里报合醉链反应(MPCR)和产物检测(参考)

A2.1寡核昔酸引物的合成由中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所军团病课题组设计的一对引物，用以扩增嗜肺军团菌，可产生2066$〕的产物(mil)基因片段)。另一对引物为扩增16SrRNA用。不仅可检测嗜肺军团菌种，而且可以检测某些非嗜肺军团菌种。

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A2.2扩增程序在容积为0.5ml的Eppendorf离心管中加人(100PI):10XPCR缓冲液1/10体积dNTPs200pmol/LTaq酶2units引物(1,2)(cnip)0.2pmol/I引物(3,4)(16SrRNA)0.05pmol/I.模板DNA(可用至2pg，取决于靶序列含量)加灭菌三蒸水至最终体积100川，最后加人40风的灭菌石蜡油。试验分别设立阳性对照和阴性对照各一份。A2.3循环参数94C61C72C循环次数首次循环2min45s45s1正式循环45，45s45s30末次循环45s45s2minI取扩增产物10讨.加人2皿6X澳酚蓝电泳指示缓冲液，在含有0.5pg/ml的嗅化乙锭的琼脂糖凝胶，于。.5XTBE(或TAE)缓冲液中进行电泳，电压5V/cm，电泳30min后，在紫外灯下观察结果、A2.4结果凝胶中出现两条特异性DNA带〔分别为206个碱基对(206by)及386个碱基对(386bp)〕或一条特异性DNA带(386by)则PCR为阳性，如重复试验后未出现特异性DNA带，则PCR结果为阴性。如待检材料(痰、支气管灌洗液、血液等)PCR阳性，则提示标本中有特异性军团菌DNA片段，出现两条特异性DNA带为嗜肺军团菌感染，一条特异性DNA带为非嗜肺军团菌感染。

A3协同凝集试验(参考)

此法原理是利用金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)可与某些动物IgG的Fe段结合的特性，将军团菌的特异性抗