DB3301/T 1096-2018 南美白对虾肝肠胞虫聚合酶链式反应检测方法

ICS65.150

B50

DB3301

浙江省杭州市地方标准

DB3301/T1096—2018

南美白对虾肝肠胞虫聚合酶链式反应检测

方法

2018-09-05发布2018-10-05实施

杭州市质量技术监督局发布

前  言

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。

本标准由杭州市农业局提出并归口。

本标准起草单位：杭州市水产技术推广总站、杭州萧山农技推广中心水产站、杭州大洋庄

园农业发展有限公司。

本标准主要起草人：叶键、施礼科、许婷、王力、徐铃威、陈凡、蒋静、韩钶、王国成。

DB3301/T1096—2018

南美白对虾肝肠胞虫聚合酶链式反应检测方法

1范围

本标准规定了南美白对虾肝肠胞虫（Enterocytozoonhepatopenaei，EHP）聚合酶链式反应（PCR）

检测的材料、仪器和设备、操作步骤和结果判定。

本标准适用于南美白对虾肝肠胞虫的定性检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

SC/T7103水生动物产地检疫采样技术规范

3检测材料

3.1水

符合GB/T6682中一级水的要求。

3.2Taq酶

-20℃保存，避免反复冻融。

3.3dNTPs

含dCTP、dGTP、dATP、dTTP各10mmol/L，-20℃保存。

3.4引物

有两对引物，浓度均为25μmol/L，其序列分别为：

F1：5’-CAGCAGGCGCGAAAATTGTCCA-3’

R1：5’-AAGAGATATTGTATTGCGCTTGCTG-3’，扩增778bp的片段；

F2：5’-CAACGCGGGAAAACTTACCA-3’

R2：5’-ACCTGTTATTGCCTTCTCCCTCC-3’，扩增上述片段中的176bp片段。

3.5DNA分子量标准

推荐使用DNAladder100，各片段大小依次为：1500bp，1000bp，900bp，700bp，600bp，500

bp，400bp，300bp，200bp，100bp。

3.6无水乙醇

分析纯，使用前-20℃预冷。

1

DB3301/T1096—2018

3.7矿物油

无DNA酶和RNA酶。

4仪器和设备

4.1PCR扩增仪

4.2电泳仪

输出直流电压0V～600V。

4.3水平电泳槽

50mL～500mL，带有凝胶船及样孔梳。

4.4移液器

量程0.5L～10L、10L～100L、100L～1000L移液器各1支及适配吸头，0.5L～10L

移液器建议使用带滤芯吸头。

4.5紫外透射仪或凝胶成像仪

可遮挡可见光干扰，在230nm～300nm波长对凝胶发射紫外线，推荐带照相功能。

4.6恒温培养箱

4.7冰箱

具冷藏箱，并带-20℃以下冷冻箱体。

4.8离心机

转速可达15000r/min以上。

5操作步骤

5.1采样

将待检虾置于采样容器内，加10倍体积以上的95%乙醇，没过待检样，常温保存，可保存30d。采

样数量应符合SC/T7103水生动物产地检疫采样技术规范的要求。

5.2样品处理

将待检虾置于灭菌滤纸上，滤干乙醇。幼体、仔虾及小于2cm的幼虾取完整个体。大于2cm的幼虾、

亚成年虾及成虾取肝胰腺组织。充分研磨混匀后取10