DB45/T 2171-2020 甘蔗品种真实性鉴定 SSR分子标记法

ICS65.020.20

B0505B

DB45

广西壮族自治区地方标准

DBDB45/T2171—2020

甘蔗品种真实性鉴定SSR分子标记法

SSR-basedmethodsforvarietygenuinenesstestingofsugarcaneoftestinggenuinenessvarietyformethodsSSR-based

2020-10-29发布2020-11-30实施

广西壮族自治区市场监督管理局发布

DB45/T2171—20202171—2020DB45/T

前前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则

起草。

本文件由广西壮族自治区分析测试研究中心提出并宣贯。

本文件由广西糖业标准化技术委员会归口。

本文件起草单位：广西益谱检测技术有限公司、广西博测检测技术服务有限公司、广西吉锐安全技

术有限公司、广西壮族自治区分析测试研究中心。

本文件主要起草人：梁俊、刘守廷、黄易勤、苏丽梅、杜寒春、黄小娟、刘巧频、何慧、梁群清、

莫璋红、韦秋翠、韦秀兰。

I

DB45/T2171—20202171—2020DB45/T

甘蔗品种真实性鉴定SSR甘蔗品种真实性鉴定分子标记法

11范围

本文件规定了利用简单重复序列（SSR）标记进行甘蔗品种真实性鉴定的操作程序、数据记录与统

计、判定方法。

本文件适用于甘蔗品种SSR指纹数据采集及品种真实性鉴定。本文件适用于甘蔗品种SSR指纹数据采集及品种真实性鉴定。

22规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法6682GB/T

GB19489实验室生物安全通用要求19489GB

33术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.13.1

推荐引物recommendedprimerprimerrecommended推荐引物

品种鉴定中优先选用一套简单重复序列（SSR）引物，其检测位点具有多态性高、重复性好等综合

特性。

3.23.2

对照品种controlvarietyvarietycontrol对照品种

对照品种具有所用SSR位点上不同等位变异的特性。对照品种用于辅助确定待测样品的等位变异，

校正仪器设备的系统误差。

44缩略语

下列缩略语适用于本文件。

SSR：简单重复序列（Simplesequencerepeats）；repeats）；sequenceSSR：简单重复序列（Simple

应（P酶链式反PCR：聚合olCymeraseReactihainon）；

：脱氧核DNA糖核酸（Deoxyriboacinucleicd）。

55原理

次依据甘蔗品种基因组中SSR的重复扩增数存在差异，通过PCR及电泳技术可以鉴定甘蔗品种。

1

DB45/T2171DB45/T—2020

66材料和试剂

除另有说明外，本文件中使用分析纯（含）以上试剂，用水符合GB/T6682规定的二级水，其中PCR

用水要求达到一级水指标。

6.16.1试剂

6.1.16.1.1三羟甲基氨基甲烷（C4H11NO3）：纯度＞99%。

6.1.26.1.2乙二胺四乙酸二钠(EDTA·2Na)：纯度≥99.0%。

6.1.36.1.3硼酸（H3BO3）：ρ=1.43g/cm³，含量≥99.5%。

6.1.46.1.4十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）：ρ=1.32g/mL，纯度≥99.0%。

6.1.56.1.5氯化钠（NaCl）：ρ=2.165g/cm³，含量≥99.5%。

6.1.66.1.6琼脂糖。

6.1.76.1.7过硫酸铵（(NH4)2S2O8）：ρ=1.98g/cm³，含量≥98.0%。

6.1.86.1.8氢氧化钠(NaOH）：ρ=2.13g/cm³，含量≥96.0%。

6.1.96.1.9硝酸银（AgNO3）：ρ=4.35g/cm³，含量≥98.0%。

6.1.106.1.10甲醛（HCHO）：ρ=0.815g/cm³。

6.1.116.1.11液氮（N2）：ρ=0.81g/cm³。

6.1.126.1.12三氯甲烷（CHCl3）：ρ=1.50g/cm³。

6.1.136.1.13无水乙醇（CH3CH2OH）：ρ=0.79g/cm³，含量≥99.7%。

6.1.146.1.14DNA分析仪用LIZ500分子量内标。

6.1.156.1.15去离子甲酰胺（CH3NO）：ρ=1.133g/mL。

6.1.166.1.1640%丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺溶液（AcrySl/Bisolution(29:1)）。

6.1.176.1.17四甲基乙二胺（TEMED）：ρ=1.32g/mL。

6.1.186.1.18DNA分子量标准（DNAmarker）：可以清楚区分50bp～500bp的DNA片段。

6.1.196.1.192×PCRPlusTaq预混试剂：0.1U/μLPPlusTaqolymerase、500μMdNeacTPh、20mM

Tris-HCl(pH=8.3)、100mMKCl、3mMMgCl2、稳定剂、增强剂。

6.26.2溶液配制

6.2.16.2.15×TBE缓冲液

称取5.4g三羟甲基氨基甲烷（6.1.1）、0.372g乙二胺四乙酸二钠（6.1.2）和2.75g硼酸（6.1.3）

溶于70mL纯水中，定容至100mL，在103.4kPa（121℃）条件下灭菌20min。

6.2.26.2.20.5×TBE缓冲液

量取100mL浓度5×TBE缓冲液（6.2.1）于烧杯中，加入900mL纯水混匀。

6.2.36.2.3CTAB提取溶液

称取4g十六烷基三甲基溴化铵（6.1.4）、16.38g氯化钠（6.1.5）、1.21g三羟甲基氨基甲烷（6.1.1）、

1.49g乙二胺四乙酸二钠（6.1.2）溶于7m0L纯水，定容至m200L，在103.4kPa（121℃）条件下灭菌

20min。

6.2.46.2.4无菌纯水

纯水在103.4kPa（121℃）条件下灭菌20min。

2

DB45/T2171—20202171—2020DB45/T

6.2.56.2.51%琼脂糖溶液

1g琼脂糖（6.1.6）溶于100mL5×的0.TBE缓冲液（6.2.2），适当加热融化。

6.2.66.2.610%过硫酸铵溶液

称取10g过硫酸铵（6.1.7），加入100mL纯水溶解。

6.2.76.2.7电泳缓冲液

108称取108g三羟甲基氨基甲烷（6.1.1）、7.44g乙二胺四乙酸二钠（6.1.2）、55g硼酸（6.1.3）、

0.8g氢氧化钠（6.1.8），加入10L纯水溶解。

6.2.86.2.8染色液

称取0.2（6.1.9），g硝酸银加入400mL纯水溶解。

6.2.96.2.9显色液

称取4g氢氧化钠（6.1.8），加入400mL纯水溶解，临用时再加1.6mL甲醛（6.1.10）。

77仪器和设备

7.17.1电子天平：精确至0.1mg。

7.27.2恒温水浴锅。

7.37.3高速冷冻离心机：最高15000rpm。

7.47.4PCR扩增仪。

7.57.5垂直板电泳系统。

7.67.6凝胶成像系统。

7.77.7毛