YC/T 448-2012 烟草及烟草制品 游离氨基酸的测定 离子色谱-积分脉冲安培法

ICS65.160

X87

备案号:—

372382012

中华人民共和国烟草行业标准

/—

YCT4482012

烟草及烟草制品游离氨基酸的测定

离子色谱积分脉冲安培法

-

ㅤㅤㅤㅤ

——

TobaccoandtobaccoroductsDeterminationoffreeaminoacidsIon

p

chromatorahwithinteratedulsedamerometricmethod

gpygpp

2012-08-22发布2012-09-15实施

国家烟草专卖局发布

/—

YCT4482012

烟草及烟草制品游离氨基酸的测定

离子色谱积分脉冲安培法

-

1范围

本标准规定了烟草及烟草制品中游离氨基酸的离子色谱积分脉冲安培测定方法。

-

、、、、、、、、

本标准适用于烟草及烟草制品中精氨酸赖氨酸色氨酸丙氨酸苏氨酸甘氨酸缬氨酸丝氨酸

、、、、、、、、、

脯氨酸异亮氨酸亮氨酸甲硫氨酸组氨酸苯丙氨酸谷氨酸天冬氨酸胱氨酸酪氨酸等种常见

18

游离氨基酸的测定。

本方法测定烟草及烟草制品中游离氨基酸的检出限和定量限见附录A。

2规范性引用文件

。,

下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件仅注日期的版本适用于本文

。,()。

件凡是不注日期的引用文件其最新版本包括所有的修改单适用于本文件

/分析实验室用水规格和试验方法

GBT6682

/烟草及烟草制品试样的制备和水分测定烘箱法

YCT31

ㅤㅤㅤㅤ

3原理

,,,

盐酸溶液萃取试样中的游离氨基酸过阳离子固相萃取小柱纯化离子色谱积分脉冲安培仪测定

-

外标法定量。

4试剂与材料

,,/。

除特别要求外应使用优级纯试剂水应符合GBT6682中一级水的规定

,。

4.1甲醇色谱纯

(,)。

4.2磺基水杨酸溶液8%质量分数

氢氧化钠溶液,/。

4.3250mmolL

(),,

称取50.0g氢氧化钠纯度大于99.9%加入盛有50mL水的聚四氟乙烯烧杯中溶解冷却后得

,,。

到质量分数为50%的氢氧化钠溶液移取13.1mL上层清液于1000mL容量瓶中用水定容至刻度

醋酸钠溶液,/。

4.41.0molL

(),,

称取醋酸钠纯度大于于烧杯中溶解冷却后转移至容量瓶中

82.0g99.9%100mL1000mL

用水定容至刻度。

:,/。

4.5萃取溶液盐酸溶液0.1molL

(),,

移取浓盐酸质量分数为于烧杯中溶解冷却后转移至容量瓶中

8.4mL37%100mL1000mL

用水定容至刻度。

盐酸溶液,/。

4.60.01molL

(),。

移取萃取溶液于容量瓶中用水定容至刻度

10mL4.5100mL

4氨溶液,/。

.73molL

1

/—

YCT4482012

(),,

移取200mL浓氨水质量分数为28%于500mL烧杯中溶解冷却后转移至1000mL容量瓶中

用水定容至刻度。

4.8标准溶液

4.8.1混合氨基酸标准储备液

称取约天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、

33mg29mg26mg36mg18mg22mg

缬氨酸、胱氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯

29mg60mg37mg32mg32mg45mg41mg

、、、、、,,

丙氨酸38mg组氨酸51mg色氨酸36mg赖氨酸43mg精氨酸28mg脯氨酸精确至0.1mg混合

(),,(),

后使用萃取溶液4.5溶解转移至100mL容量瓶中用萃取溶液4.5定容至刻度即配制成浓度约

/。,

为的种氨基酸混合标准储备液该标准储备溶液在冰箱内保存有效期为

2.5molmL184℃

μ

1个月。

4.8.2标准工作溶液

(),()

分别准确移取一定量的混合氨基酸标准储备溶液4.8.1用萃取溶液4.5配制成各氨基酸浓度

均约为/、/、/、/、/、/的系列混

4nmolmL20nmolmL50nmolmL125nmolmL250nmolmL2500nmolmL

。,。

合氨基酸标准工作溶液该标准工作溶液在冰箱内保存有效期为个月

4℃1

,。

4.9高纯氮气纯度≥99.999%

5仪器与设备

常用实验仪器以及下述各项。

,/,。

5.1离心机转速调节为12000rmin配5mL锥形离心管

,。

5.2分析天平感量为0.1mg

ㅤㅤㅤㅤ

5.3水相滤膜,。

0.22m

μ

、,,。

容量瓶移液管等常用玻璃器皿使用前用水淋洗次室温下晾干备用

5.43

固相萃取小柱:,()

5.54mL500mg强阳离子交换固相萃取小柱使用前依次经过3mL甲醇4.1和

3mL水活化后备用。

,()/。

5.6振荡器振荡频率40~300rmin

5.7快速滤纸。

5.8氮吹仪。

,。

5.9离子色谱仪配置电化学检测器和25L定量环

μ

6分析步骤

6.1仪器设定参数

。,。

按照制造商操作手册运行离子色谱仪以下分析条件可供参考采用其他条件应验证其适用性

———:,,;

色谱柱氨基酸阴离子交换柱固定相为聚二乙烯基苯官能团为功能性季铵盐包括分析柱

()(),;

250mm×2mm和保护柱50mm×2mm或性能相当的离子色谱柱

———柱温:;

32℃

———流速:/;

0.25mLmin

———进样量:;

25L

μ

———::;:/();:/

流动相流动相水流动相氢氧化钠溶液流动相醋酸钠

AB250mmolL4.3C1molL

();;

溶液4.4梯度洗脱程序见表1

———,。

检测器为电化学检测器积分安培检测电化学波形见表2

2

/—

YCT4482012

表1梯度洗脱程序

时间////

minA%B%C%

076240

276240

864360

1164360

18402040

21441640

23141670

42141670

42.120800

44.120800

44.276240

7576240

表2积分安培检测电化学波形

时间//(/)(、)

s电位Vvs.H-AACl参比电极积分开始结束

pgg

ㅤㅤㅤㅤ

00.13

0.040.13

0.050.33

0.210.33开始

0.220.6

0.460.6

0.470.33

0.560.33结束

0.57-1.67

0.58-1.67

0.590.93

0.600.13

6.2样品制备

/,。

按YCT31制备试样并测定试样水分含量

、:,,

烤烟烟叶香料烟叶和烤烟型卷烟称取约1.0g试样精确至0.1mg置于100mL磨口锥形瓶

,(),(),/,

中准确加入40mL萃取溶液4.5具塞后置于振荡器5.6振荡30min振荡频率为150rmin将萃

()。,(),,

取液经快速滤纸5.7过滤准确移取滤液2mL再准确加入2mL磺基水杨酸溶液4.2混合均匀

。(),()

离心30min准确移取上清液1mL过固相萃取小柱5.5然后用0.5mL盐酸溶液4.6淋洗固相萃

3

/—

YCT4482012

,()。,

取小柱最后使用3mL氨溶液4.7洗脱将洗脱液在65℃水浴和氮气保护下吹干准确加入1mL

(),()。

萃取溶液4.5溶解过水相滤膜5.3后待测

:,,,

白肋烟叶和混合型卷烟称取0.25g试样精确至0.1mg置于100mL磨口锥形瓶中准确加入

(),(),/,

40mL萃取溶液4.5具塞后置于振荡器5.6振荡30min振荡频率为150rmin将萃取液经快速滤

()。,(),,。

纸5.7过滤准确移取滤液2mL再准确加入2mL磺基水杨酸溶液4.2混合均匀离心30min

(),(),

准确移取上清液1mL过固相萃取小柱5.5然后用0.5mL盐酸溶液4.6淋洗固相萃取小柱最后

()。,

使用3mL氨溶液4.7洗脱将洗脱液在65℃水浴和氮气保护下吹干准确加入1mL萃取溶液

(),()。。

4.5溶解过水相滤膜5.3后待测试样的称取量根据试样中氨基酸的含量不同而不同

6.3标准曲线的制作

(),

对标准工作溶液4.8.2进行离子色谱测定以分析物氨基酸的浓度与其响应峰面积绘制标准曲

2

,。。

线相关系数R应不小于0.99氨基酸标准溶液离子色谱图参见附录B

6.4试样测定

(),()。

按照仪器测试条件6.1测定试样根据标准曲线6.3计算相应浓度典型样品离子色谱图参见

附录C。

7结果与表述

7.1结果计算

():

样品中氨基酸的含量按式计算得出

1

ㅤㅤㅤㅤ

kCVM

×××1

Xii…………()

i=×1

()

m1w1000

-

式中:

———,(/);

Xi样品中氨基酸的含量单位为毫克每克mgg

k———稀释倍数;

———,(/);

C由标准曲线得出的氨基酸浓度单位为微摩尔每毫升molmL

iμ

———,():

V萃取溶液体积单位为毫升mL

———,(/);

Mi氨基酸分子量单位为克每摩尔gmol

———,();

m样品质量单位为克g

w———样品水分质量分数。

7.2结果表述

,/。

以两次平行测定的平均值为测定结果结果精确至0.001mgg两次平行测定结果之间的相对平

均偏差应不大于10%。

、

8回收率检出限和定量限

本方法的回收率结果参见附录D。

9试验报告

试验报告应说明:

4

/—

YCT4482012

———识别被测试样需要的所有信息;

———参照本标准所使用的试验方法;

———,;

测定结果包括各单次测定结果及其平均值

———与本标准规定的分析步骤的差异;

———在试验中观察到的异常现象;

———试验日期;

———测定人员。

ㅤㅤㅤㅤ

5

/—

YCT4482012

附录

A

()

规范性附录

本方法的检出限和定量限结果

本方法的检出限和定量限结果如表A.1所示。

表A.1本方法的检出限和定量限结果

检出限定量限

化合物

ng/mLng/mL

精氨酸()

Ar3.26410.880

g

赖氨酸()

Ls3.72512.417

y

丙氨酸()

Ala7.24224.140

苏氨酸()6.16420.547

Thr

甘氨酸()

Gl4.85216.173

y

缬氨酸()

Val27.01290.040

丝氨酸()

Ser6.85122.837

脯氨酸()24.93883.127

Pro

异亮氨酸()

Ile32.989109.963

亮氨酸()ㅤㅤㅤㅤ

Leu39.958133.193

蛋氨酸()

Met20.43168.103

组氨酸()3.93813.127

His

苯丙氨酸()

Phe6.53821.793

谷氨酸()

Glu15.11650.387

天冬氨酸()

As9.02430.080

p

胱氨酸()11.83639.453

Cs

y

酪氨酸()

Tr12.11840.393

y

色氨酸()

Tr8.98929.963

p

6

/—

YCT4482012

附录

B

()

资料性附录

色谱图示例

,,。

按照本标准所规定方法对标准溶液进行离子色谱分析所得到色谱图如图B.1所示

———精氨酸();

1Ar

g

———赖氨酸();

2Ls

y

———丙氨酸();

3A1a

ㅤㅤㅤㅤ

———苏氨酸();

4Thr

———甘氨酸();

5G1y

———缬氨酸();

6Val

———丝氨酸();

7Ser

———脯氨酸();

8Pro

———异亮氨酸();

9Ile

———亮氨酸();

10Leu

———蛋氨酸();

11Met

———组氨酸();

12His

———苯丙氨酸();

13Phe

———谷氨酸();

14Glu

———天冬氨酸();

15As

p

———胱氨酸();

16Cs

y

———酪氨酸();

17Tr

y

———色氨酸()。

18Tr

p

图B.1标准溶液色谱图示例

7

/—

YCT4482012

附录

C

()

资料性附录

色谱图示例

典型样品色谱图如图C.1所示。

———精氨酸();

1Ar

g

———赖氨酸();

2Ls

y

———丙氨酸();

3Ala

———苏氨酸();

4Thr

———甘氨酸();

5Gl

y

ㅤㅤㅤㅤ

———缬氨酸();

6Val

———丝氨酸();

7Ser

———脯氨酸();

8Pro

———异亮氨酸();

9Ile

———亮氨酸();

10Leu

———蛋氨酸();

11Met

———组氨酸();

12His

———苯丙氨酸();

13Phe

———谷氨酸();

14Glu

———天冬氨酸();

15As

p

———胱氨酸();

16Cs

y

———酪氨酸();

17Tr

y

———色氨酸()。

18Tr

p

图C.1典型样品色谱图示例

8

/—

YCT4482012

附录

D

()

资料性附录

本方法的回收率结果

本方法的回收率结果如表D.1所示。

表D.1本方法的回收率结果

回收率

化合物加标浓度

%

低标88.73

精氨酸()中标90.12

Ar

g

高标90.08

低标94.06

赖氨酸()中标93.26

Ls

y

高标103.21

低标92.86

丙氨酸()中标105.51

Ala

高标93.25

ㅤㅤㅤㅤ

低标96.25

苏氨酸()中标

Thr91.79

高标97.18

低标99.36

甘氨酸()中标

Gl92.92

y

高标103.05

低标89.35

缬氨酸()中标91.34

Val

高标90.69

低标90.98

丝氨酸()中标

Ser