DB22/T 2559-2016 牛新孢子虫病检测方法 LAMP法

ICS11.220

B41

DB22

吉林省地方标准

DB22/T2559—2016

牛新孢子虫病检测方法LAMP法

LAMPassayfordetectionofbovineNeosporaosis

2016-12-09发布2017-03-01实施

吉林省质量技术监督局发布

DB22/T2559—2016

前言

本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2015给出的规则起草。

本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。

本标准起草单位：延边大学、吉林省动物疫病预防控制中心。

本标准主要起草人：贾立军、柴方红、张守发、梁晚枫。

I

DB22/T2559—2016

牛新孢子虫病检测方法LAMP法

1范围

本标准规定了牛新孢子虫病LAMP检测方法的技术要求。

本标准适用于牛新孢子虫病病原检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件

3.1

新孢子虫病Neosporiasis

由犬新孢子虫(Neosporacaninum)引起的多种动物的一种原虫病，该病主要引起母畜的流产、死胎

或新生胎儿的运动障碍和神经系统疾病。

3.2

环介导等温扩增(LAMP)Loop-mediatedisothermalamplification

针对靶基因的6个区域设计4种特异性引物，利用一种链置换DNA聚合酶在等温条件下(63℃左右)保

温30min～60min，使得链置换DNA合成在不停地自我循环，即而完成的核酸扩增反应。

4试剂

除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯；实验用水符合GB/T6682中一级水的要求。

4.1常规试剂

4.1.1100mg/mL溶菌酶见附录A.1。

4.1.210mg/mL蛋白酶K见附录A.2。

4.1.310%十二烷基磺酸钠见附录A.3。

4.1.45%十六烷基三甲基溴化铵见附录A.4。

4.1.5TE（pH8.0）见附录A.5。

4.1.650×TAE缓冲液见附录A.6。

4.1.7加样缓冲液见附录A.7。

4.1.81.5%琼脂糖凝胶的制备见附录A.8。

4.2分子生物学试剂

1

DB22/T2559—2016

BstDNAPolymerase、SYBRGreenⅠ、限制性内切酶TaqⅡ、组织DNA提取试剂盒、血液DNA提取试

剂盒、溴化乙锭、DNAMarker分子量标准等。使用或稀释时均参照试剂说明书进行。

4.3引物

表1LAMP特异性引物序列及浓度

引物引物序列引物浓度

F3ATGCTTGTGTGGTGAGGC0.2µmol/L

B3CAAGTGCCACCCACTGATC0.2µmol/L

FIPCGCTGACCGATCGGTTAACTGATTGCCAAACTCAGTGCGT1.6µmol/L

BIPTTAGCAGTTGGGGTGTCGGGTACCCTGTTTCGGGAGACA1.6µmol/L

4.4标准阳性、阴性对照

4.4.1标准阳性样品为犬新孢子虫基因组DNA提取物，DNA浓度为10mg～30mg。制备方法见附录B。

4.4.2标准阴性样品健康牛组织DNA提取物，DNA浓度为10mg～30mg。

5仪器设备

5.1低温高速离心机（12000g以上）。

5.2恒温水