DB44/T 2336-2021 实验动物 病毒PCR定性分析

ICS65.020.30

CCSB44

44

广东省地方标准

DB44/T2336—2021

实验动物病毒PCR定性分析

LaboratoryanimalQualitativeanalysisofviruswithpolymerasechainreaction

method

2021-10-18发布2022-01-18实施

广东省市场监督管理局发布

DB44/T2336—2021

目次

前言.................................................................................II

1范围...............................................................................1

2规范性引用文件.....................................................................1

3术语和定义.........................................................................1

4缩略语.............................................................................2

5原理...............................................................................2

6主要设备和材料.....................................................................2

7试剂...............................................................................3

8方法...............................................................................3

9结果..............................................................................10

10防止交叉污染的措施...............................................................11

附录A（规范性）溶液的配制..........................................................12

附录B（规范性）引物及探针序列......................................................14

参考文献.............................................................................18

I

DB44/T2336—2021

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由广东省科学技术厅提出并组织实施。

本文件由广东省实验动物标准化技术委员会（GD/TC93）归口。

本文件起草单位：广东省实验动物监测所。

本文件主要起草人：王静、袁文、闵凡贵、潘金春、黄树武、罗银珠、何丽芳、张钰、黄韧。

II

DB44/T2336—2021

实验动物病毒PCR定性分析

1范围

本文件规定了实验动物病毒的PCR定性分析方法。

本文件适用于实验动物相关病毒核酸的定性分析。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB19489实验室生物安全通用要求

GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

聚合酶链式反应polymerasechainreaction，PCR

体外酶催化合成特异DNA片段的方法，模板DNA先经高温变性成为单链，在DNA聚合酶作用和适宜的

反应条件下，根据模板序列设计的两条引物分别与模板DNA两条链上相应的一段互补序列发生退火而相

互结合，接着在DNA聚合酶的作用下以四种dNTP为底物，使引物得以延伸，然后不断重复变性、退火和

延伸这一循环，使欲扩增的基因片段以几何倍数扩增。

逆转录-聚合酶链式反应reversetranscription-polymerasechainreaction，RT-PCR

以RNA为模板，采用Oligo（dT）、随机引物或特异性引物，RNA在逆转录酶和适宜反应条件下，被

逆转录成cDNA，然后再以cDNA作为模板，进行PCR扩增。

巢式PCRnestedpolymerasechainreaction

巢式PCR通过两轮PCR反应，使用两套引物扩增特异性DNA片段。第一对PCR引物扩增片段和普通PCR

相似。第二对引物以第一轮PCR产物为模板，特异性地扩增位于首轮PCR产物内的一段DNA片段，从而大

大提高了反应的敏感性和特异性。

实时荧光聚合酶链式反应real-timePCR，实时荧光PCR

实时荧光PCR方法是在普通PCR的基础上，在反应体系中加入特异性荧光探针，利用荧光信号积累实

时报告整个PCR进程，通过读取每次循环反应中的荧光发射信号，间接反映了PCR扩增的目标基因的量，

最后通过扩增曲线对未知模板进行定性或定量分析。

1

DB44/T2336—2021

实时荧光逆转录-聚合酶链式反应real-timeRT-PCR，实时荧光RT-PCR

实时荧光RT-PCR方法是在RT-PCR的基础上，在反应体系中加入特异性荧光探针，利用荧光信号积累

实时报告整个PCR进程，通过读取每次循环反应中的荧光发射信号，间接反映了PCR扩增的目标基因的量，

最后通过扩增曲线对未知模板进行定性或定量分析。

Ct值cyclethreshold

实时荧光PCR反应中每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

cDNA互补DNA（complementaryDNA）

CPE细胞病变效应（cytopathiceffect）

DEPC焦碳酸二乙酯（diethylpyrocarbonate）

DNA脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）

EDTA乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid）

PBS磷酸盐缓冲液（phosphatebufferedsaline）

RNA核糖核酸（ribonucleicacid）

TAE三羟甲基氨基甲烷-乙酸-乙二胺四乙酸缓冲液（tris-acetateEDTA）

5原理

用合适的方法提取样本中的总RNA或/和DNA，分别针对病毒保守基因设计特异的引物探针序列，通

过普通PCR或实时荧光PCR反应对模板进行扩增，根据PCR反应结果分析该样品中是否含有某种病毒。

6主要设备和材料

PCR仪。

实时荧光PCR仪。

电泳仪。

凝胶成像分析系统。

高速冷冻离心机。

普通离心机。

恒温孵育器。

漩涡振荡器。

组织匀浆器。

微量核酸定量仪。

生物安全柜。

PCR超净工作台。

冰箱（-20℃、-80℃）。

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微量移液器：0.1µL～2µL，1µL～10µL，10µL～100µL，100µL～1000µL。

灭菌离心管（1.5mL、2mL、5mL、15mL），灭菌吸头（10µL，200µL，1mL），灭菌PCR扩

增反应管（0.2mL，八连管或96孔板）。

采样工具：剪刀、镊子和灭菌棉拭子等。

7试剂

以下所用的试剂除特别注明者外均为分析纯，实验用水为双蒸水或去离子水，应符合GB/T6682

所规定一级水的要求。所有涉及分子生物学操作的水均为无DNA酶、无RNA酶水。

灭菌PBS。配制方法见附录A。

PCR用水：经DEPC处理的水或商品无DNA酶、无RNA酶水，配制方法见附录A。

RNA抽提试剂：TRIzol或其他类似产品。

DNA抽提试剂：基因组DNA提取试剂盒DNeasyBlood&TissueKit或其他类似产品。

注：DNA提取试剂盒是由Qiagen公司提供的DNeasyBlood&TissueKit。给出这一信息是为了方便本文件使用者，

并不表示对这一产品的认可。亦可使用其他类似的DNA提取试剂盒进行。

无水乙醇。

75%乙醇：使用DNA酶、无RNA酶水配制为75%乙醇。

三氯甲烷（氯仿）。

异丙醇。

PCR试剂：PremixTaqTM（Version2.0plusdye）、PremixExTaq™（ProbeqPCR）、OneStep

PrimerscriptTMRT-PCRKit（PerfectRealtime）或其他类似产品。

注：以上PCR试剂是是由Takara公司提供的商品试剂盒，是本文件适合的市售产品的使用实例，给出这一信息是为

了方便本文件使用者，并不表示对这一产品的认可。亦可使用其他类似的PCR试剂。

DNA相对分子质量标准：100bp～2000bp。

50×TAE电泳缓冲液，配制方法见附录A。

溴化乙锭：10mg/mL，配制方法见附录A或其他类似产品。

1.5%琼脂糖凝胶，配制方法见附录A。

引物和探针：引物和探针序列见附录B。根据附录B中表B.1和表B.2序列合成引物和探针，引

物和探针加入无DNA酶、无RNA酶水配制成10µmol/L储备液，-20℃保存。

8方法

生物安全措施

对于可能潜在人兽共患病的样本，应在生物安全二级及以上实验室进行操作，采样应在生物安全柜

中进行。实验操作及处理按照GB19489的规定，由具备相关资质的工作人员进行相应操作。

采样及样本的处理

采样过程中样本不得交叉污染，采样及样本前处理过程中须戴一次性手套。采样及样本处理过程操

作人员应做好个人防护。

8.2.1脏器组织

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DB44/T2336—2021

剖检，无菌采集动物脏器，剪取待检样本0.5g～2g，加入5倍体积灭菌PBS，使用匀浆器充分匀浆

1min～2min，然后将组织悬液在4℃，8000g离心10min，取上清液转入另一无菌5mL离心管中，

编号备用。

8.2.2盲肠内容物或粪便

无菌采集动物盲肠内容物或粪便，取待检样本1g～2.0g于无菌5mL离心管，加入5倍体积灭菌PBS，

使用匀浆器充分匀浆1min～2min，8000g离心5min，上清液转入另一无菌5mL离心管中，编号备

用。

8.2.3血液样本

无菌采集动物血液0.2mL～0.5mL，加入柠檬酸钠或EDTA抗凝管中，轻轻颠倒混匀3次～5次，编号

备用。

8.2.4拭子取样

对活体动物取样可采集肛拭子、口腔拭子、鼻拭子，皮肤拭子、泄殖腔拭子等，浸泡于3mL无菌PBS

中5min～10min，充分混匀后，4℃，8000g离心5min，取离心上清液转入另一无菌5mL离心管中，

编号备用。

8.2.5细胞培养物

应通过以下任一方法取样：

——直接刮取样本接种后出现CPE或可疑的细胞培养物置于无菌15mL离心管中，1500g离心

5min，弃上清，加1mL灭菌PBS重悬细胞，将细胞悬液转移到无菌1.5mL离心管，编号

备用；

——将样本接种后出现CPE或可疑的细胞培养物反复冻融三次，细胞混悬液转移于无菌离心管

中，8000g离心5min，弃细胞碎片，上清液转移到无菌15mL离心管中，编号备用。

8.2.6饲料、垫料和饮水

饲料、垫料：取约5g～10g饲料和垫料置于50mL无菌离心管中，加入3倍体积灭菌PBS（饲料和垫

料需全部浸泡于液体中）。密封后浸泡5min～10min，充分混匀，将混悬液转移至15mL无菌离心管，

4℃，8000g离心5min，取上清液转入另一无菌5mL离心管中，编号备用。

饮水：取200µL～1000µL实验动物饮水直接转移到无菌1.5mL离心管中，编号备用。

8.2.7设施设备

用灭菌棉拭子拭取实验动物设施设备出风口初效滤膜表面约5cm2沉积物，将拭子置入灭菌15mL离

心管，加入适量灭菌PBS，浸泡5min～10min，充分混匀，取出棉拭子，将离心管于4℃，8000g离

心5min，取上清液转入另一无菌5mL离心管中，编号备用。

8.2.8样本的存放

采集或处理的样本在2℃～8℃条件下保存应不超过24h，若需长期保存，须放置于-80℃冰箱，

但应避免反复冻融。

8.2.9采样废弃物处理

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采样结束，动物尸体应使用生物安全垃圾袋包装完整，高压灭菌后交由医疗垃圾处理单位进行处理，

采样器材应使用消毒液浸泡或高压灭菌消毒，并做好实验台面及采样室的消毒。

核酸提取

8.3.1样本RNA提取

8.3.1.1取200µL处理后的样本加1mLTRIzol后，充分混匀，室温静置10min使其充分裂解。

8.3.1.2加入200µL氯仿，盖紧样本管盖，用手用力振荡摇晃离心管15s，禁用漩涡振荡器，以免

基因组RNA断裂。室温静置5min，4℃，10000g离心15min。

8.3.1.3离心后混合物分成三层：下层红色的苯酚-氯仿层，中间层，上层无色的水样层。RNA存在于

水样层当中，水样层的容量大约为所加TRIzol容量的60%。吸取上层水相，至另一离心管中，注意不

要吸取中间界面。

8.3.1.4加入等量异丙醇混匀，室温放置10min，4℃，10000g离心10min，弃上清，RNA沉淀一

般形成一胶状片状沉淀附着于试管壁和管底。

8.3.1.5加入1mL75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。4℃，5000g离心5min，弃上清，将离

心管倒立吸水纸上，尽量使液体流干。

8.3.1.6室温自然风干5min～10min，注意RNA样本不要过于干燥，否则很难溶解。用50µL～100

µL无DNA酶、无RNA酶水溶解RNA样本。

8.3.1.7取2µL提取的RNA样本使用微量核酸定量仪测定提取RNA浓度。

8.3.1.8制备好的RNA应尽快进行下一步RT-PCR反应，若暂时不能进行PCR反应，应于-80℃冰箱

保存备用。

8.3.2样本DNA提取

8.3.2.1取50µL～100µL样本至1.5mL或2mL离心管，加20µL蛋白酶K，用PBS补加至220

µL。

8.3.2.2加入200µL缓冲液AL，涡旋震荡充分混匀，56℃孵育10min。

8.3.2.3加入200µL的无水乙醇，涡旋震荡充分混匀。

8.3.2.4将第8.3.2.3条制备的混合液加入离心柱中，离心柱放在2mL收集管上。≥6000g离心1

min后弃收集管/液。

8.3.2.5离心柱放至新的2mL收集管，加500µL缓冲液AW1，≥6000g离心1min后弃收集管/液。

8.3.2.6离心柱放至新的2mL收集管，加500µL缓冲液AW2，20000g离心3min。弃收集管/液。

8.3.2.7将离心柱放在一个新的1.5mL离心管上，吸200µL的缓冲液AE在吸附膜上，室温孵育1

min，≥6000g离心1min。收获DNA提取液。

8.3.2.8取2µL提取的DNA样本使用微量核酸定量仪测定提取DNA浓度。

8.3.2.9制备好的DNA应尽快进行下一步PCR反应，若暂时不能进行PCR反应，应于-20℃冰箱保存

备用。

注：该DNA提取方法是针对DNA提取试剂盒DNeasyBlood&TissueKit给出的应用实例，可使用其他类似的DNA提取

试剂盒进行，提取方法可做相应调整。

PCR方法

8.4.1普通PCR

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DB44/T2336—2021

8.4.1.1PCR反应体系

PCR反应体系见表1。反应液的配制在冰上操作，每次反应同时设计阳性对照、阴性对照和空白对照，

其中阳性对照以含有阳性病毒的组织或培养物提取的核酸作为阳性对照模板，其中阴性对照以不含有

阳性病毒的样本核酸（可以是正常动物组织或正常培养物）作为阴性对照模板，空白对照即为不加模板

对照（NoTemplateControl，NTC），即在反应中用水来代替模板。

表1PCR反应体系配制表

反应组份用量/µL终浓度

2×PremixTaqMix（plusdye）101×

Forwardprimer（10µmol/L）0.80.4µmol/L～1µmol/L

Reverseprimer（10µmol/L）0.80.4µmol/L～1µmol/L

DNA模板2<250ng

PCR用水6.4

总体积20

注1：可使用其他类似的PCR试剂进行，反应体系和反应参数可做相应调整。

注2：反应体系可按各反应组份终浓度配比按比例增加或减少。

8.4.1.2PCR反应参数

PCR反应参数见表2。

表2PCR反应参数

步骤温度时间循环数

预变性95℃3min1

变性98℃10s

退火50℃～60℃30s30

延伸72℃1min/kb

注：各引物退火温度及扩增条件参照附录B可作相应调整。

8.4.2RT-PCR

8.4.2.1RT-PCR反应体系

RT-PCR反应体系见表3。反应液的配制在冰浴上操作，每次反应同时设计阳性对照、阴性对照和空

白对照，其中阳性对照以含有阳性病毒的组织或培养物提取的核酸作为阳性对照模板，其中阴性对照以

不含有阳性病毒的样本核酸（可以是正常动物组织或正常培养物）作为阴性对照模板，空白对照即为不

加模板对照（NoTemplateControl，NTC），即在反应中用水来代替模板。

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表3RT-PCR反应体系配制表

反应组份用量/µL终浓度

2×1StepBuffer101×

PrimeScript1StepEnzymeMix0.8

Forwardprimer（10µmol/L）0.80