DB37/T 4153-2020 水质 肠球菌的测定 酶底物法

ICS13.060

C51

DB37

山东省地方标准

DB37/T4153—2020

水质肠球菌的测定酶底物法

Waterquality—Determinationofenterococcus—Enzymesubstratemethod

2020-09-25发布2020-10-25实施

山东省市场监督管理局发布

DB37/T4153—2020

目次

前言................................................................................II

1范围..............................................................................1

2规范性引用文件....................................................................1

3方法原理..........................................................................1

4试剂和材料........................................................................1

5仪器和设备........................................................................2

6样品..............................................................................2

7分析步骤..........................................................................2

8结果计算与报告....................................................................2

9精密度和准确度....................................................................3

10质量保证和质量控制...............................................................3

11废物处理.........................................................................3

附录A（规范性附录）51孔定量盘法不同阳性结果的最可能数（MPN）及95%可信范围........4

附录B（规范性附录）97孔定量盘法MPN表.............................................6

I

DB37/T4153—2020

前言

本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。

本标准由山东省住房和城乡建设厅提出并组织实施。

本标准由山东省城镇给水排水标准化技术委员会归口。

本标准起草单位：山东省城市供排水水质监测中心、潍坊市公用事业产品服务质量监测中心、国家

城市供水水质监测网杭州监测站、国家城市供水水质监测网福州监测站、山东省济南生态环境监测中心、

聊城水务水质检测有限公司。

本标准主要起草人：赵清华、贾瑞宝、孙韶华、褚福敏、逯南南、田立平、翁天楚、兰榕星、战锡

林、刘伟、谷荣焕、郑琳琳、吴锦铃、孟炯、王晓波。

II

DB37/T4153—2020

水质肠球菌的测定酶底物法

警告：肠球菌为致病微生物，应该在相应级别的生物安全实验室中检测，操作时应按要求佩戴生物

防护用品，注意废弃物的生物消毒。

1范围

本标准规定了测定生活饮用水及其水源水中肠球菌的酶底物法。

本标准适用于生活饮用水及其水源水中肠球菌的测定。

当水样体积为100mL时，本方法的检测限为1MPN/100mL。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T5750.2—2006生活饮用水标准检验方法水样的采集与保存

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3方法原理

肠球菌在41℃温度条件下培养24h，能够产生β-D-葡糖苷酶，将选择性培养基中荧光底物4-甲基

伞形酮β-D-葡糖苷（4-MUG）分解，分解后的荧光底物在366nm紫外光下产生荧光，统计阳性反应数量，

通过查询MPN表，计算样品中的肠球菌浓度。

4试剂和材料

4.1市售Enterolert培养基，也可以使用其他等效产品。

4.2生理盐水：氯化钠浓度为0.85%。

4.3标准菌株：粪肠球菌有证标准菌株，大肠埃希氏菌有证标准菌株。

4.4无菌水：实验用水满足GB/T6682二级及以上分析实验室用水要求，经121℃高压蒸汽灭菌20min，

备用。

4.5硫代硫酸钠：纯度≥98%。

4.6硫代硫酸钠溶液（5.0g/L）：称取0.5g硫代硫酸钠（4.5），精确至0.1g，溶于适量水中，定

容至100mL，121℃高压灭菌20min，备用。

4.7磷酸盐缓冲液（PBS）：

氯化钠8.01g

氯化钾0.2g

磷酸氢二钠1.44g

磷酸二氢钾0.24g

1

DB37/T4153—2020

上述成分溶解于950mL无菌水（4.4）中，用盐酸调节溶液pH值到7.4后加无菌水（4.4）定容至1000

mL，121℃高压灭菌20min，备用。

5仪器和设备

5.1采样瓶：具螺旋盖或磨口塞的100mL、500mL玻璃瓶。

5.2恒温培养箱：允许温度偏差41℃±1℃。

5.3高压蒸汽灭菌器：121℃可调。

5.4程控定量封口机：用于定量盘的封口。

5.5紫外灯及配套灯箱：366nm。

5.6定量盘：51孔或97孔。

5.7天平：精确至0.001g。

5.8容量瓶：10mL和100mL。

6样品

使用灭菌处理的玻璃瓶（也可选用有效期内市售无菌采样瓶和采样袋）采集水样，采样量不少于200

mL。加入硫代硫酸钠溶液（4.6）去除残留余氯（每125mL容积加入20μL的硫代硫酸钠溶液，水源水肠

球菌测定忽略此步），样品采集与保存按照GB/T5750.2—2006中微生物指标要求执行。

7分析步骤

7.1定性分析

用灭菌处理过的100mL采样瓶（5.1）量取100mL水样，加入一包培养基（4.1），混摇均匀使之完

全溶解，放入恒温培养箱（5.2）中41℃±1℃培养24h。

7.2定量分析

7.2.1用灭菌处理过的100mL采样瓶（5.1）量取100mL水样，加入一包培养基（4.1），混摇均匀使

之完全溶解。

7.2.2将上述100mL水样全部倒入51孔无菌定量盘（5.6）内，抚平定量盘背面以赶除孔穴内气泡，

然后用程控定量封口机（5.4）封口，放入恒温培养箱（5.2）中41℃±1℃培养24h。

7.3空白对照

选用无菌水（4.4）按照7.1～7.2步骤进行空白对照测定。

8结果计算与报告

8.1定性结果

定性分析（7.1）的样品，在紫外灯（5.5）下观察，产生荧光，则判定为阳性反应；不产生荧光，

则判定为阴性反应。定性反应结果以肠球菌“阳性（+）”或“阴性（-）”报告。

8.2定量结果

2

DB37/T4153—2020

定量分析（7.2）的样品，在紫外灯（5.5）下观察培养24h的定量盘，计数有荧光反应的孔数，参

照附录A表A.1计数定量，结果以MPN/100mL表示。如所有孔穴均未产生荧光，则报告肠球菌“未检出”。

若荧光不明显，可以延长培养时间至28h进行结果判读，超过28h后出现的颜色反应，不作为阳性结果。

注：对于肠球菌浓度较高的样品，可选用97孔定量盘或采用无菌生理盐水（4.2）对样品1:10梯度稀释后进行多梯

度检测，其他操作步骤同51孔定量盘法一致，结果检索表见附录B表B.1～表B.4，乘以稀释倍数报告。

9精密度和准确度

9.1精密度

6个实验室对肠球菌浓度＜30MPN/100mL的样品定性结果一致，对浓度为20.4MPN/100mL～46.3

MPN/100mL、73.1MPN/100mL～146.0MPN/100m/L的样品7次重复测定，相对标准偏差分别为1.4%～

11.2%和1.4%～6.4%。

9.2准确度

6个实验室分别测定浓度为166±32MPN/100mL的肠球菌质控样品，测定结果与认证值的相对误差在

-4.8%～0.8%范围内。

注：微生物检测数据为偏态分布，上述精密度、准确度均为对测定结果以10取对数后进行计算。

10质量保证和质量控制

10.1空白对照

每批样品进行空白对照测定，选用无菌水（4.4）按照7.3步骤进行空白对照测定，培养后的取样瓶

或定量盘应为阴性。否则，该批次样品测定结果无效，应查明原因后重新测定。

10.2阳性对照和阴性对照

定期使用粪肠球菌标准菌株（4.3）和大肠埃希氏菌标准菌株（4.3）作为阳性和阴性对照菌株，对

检测质量进行控制。将标准菌株制备成菌浓度＞10MPN/100mL的菌悬液，按照7.1～7.2步骤进行分析测

定，阳性菌株呈阳性反应，阴性菌株呈阴性反应。否则，该批次样品测定结果无效，应查明原因后重新

测定。

10.3培养基质量控制

对每批次培养基须选用有证标准菌株或标准样品进行培养基质量检验。

11废物处理

实验中产生的废弃物经高压蒸汽灭菌器（5.3）121℃灭菌20min后，作为一般废物处理。

3

DB37/T4153—2020

AA

附录A

（规范性附录）

51孔定量盘法不同阳性结果的最可能数（MPN）及95%可信范围

51孔定量盘法不同阳性结果的最可能数（MPN）及95%可信范围见表A.1。

表A.151孔定量盘法不同阳性结果的最可能数（MPN）及95%可信范围

95%置信范围

肠球菌

阳性数MPN/100mL

MPN/100mL

下限上限

0＜10.03.7

11.00.35.6

22.00.67.3

33.11.19.0

44.21.710.7

55.32.312.3

66.43.013.9

77.53.715.5

88.74.517.1

99.95.318.8

1011.16.120.5

1112.47.022.1

1213.77.923.9

1315.08.825.7

1416.49.827.5

1517.810.829.4

1619.211.931.3

1720.713.033.3

1822.214.135.2

1923.815.337.3

2025.416.539.4

2127.117.741.6

2228.819.043.9

2330.620.446.3

2432.421.848.7

2534.423.351.2

2636.424.753.9

2738.426.456.6

2840.628.059.5

4

DB37/T4153—2020

表A.151孔定量盘法不同阳性结果的最可能数（MPN）及95%可信范围（续）

95%置信范围

肠球菌

阳性数MPN/100mL

MPN/100mL

下限上限

2942.929.762.5

3045.331.565.6

3147.833.469.0

3250.435.472.5

3353.137.576.2

3456.039.780.1

3559.142.084.4

3662.444.688.8

3765.947.293.7

3869.750.099.0

3973.853.1104.8

4078.256.4111.2

4183.159.9118.3

4288.563.9