DB63/T 2288-2024 青稞品种鉴定技术规程 SNP分子标记法

ICS65.020.01

CCSB21

DB63

青海地方标准

DB63/T2288—2024

青稞品种鉴定技术规程SNP分子标记法

2024-6-19发布2024-7-25实施

青海省市场监督管理局发布

DB63/T2288—2024

前言

本文件按照GB/T1.1─2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起

草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由青海省农业农村厅提出并归口。

本文件起草单位：中国科学院西北高原生物研究所、青海省农作物种子站、海南州农牧业综合服务

中心、青海省乡村产业发展指导中心。

本文件主要起草人：王寒冬、沈裕虎、王蕾、徐金青、边海燕、韩文婷、李春桥、薛明珍、王焕强、

李俊仁、包天忠、赵璨、王健斌、陈同睿、尤恩、邓超。

本文件由青海省农业农村厅监督实施。

I

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青稞品种鉴定技术规程SNP分子标记法

1范围

本文件规定了青稞（HordeumvalgareL.var.nudumHook.f.）品种鉴定SNP分子标记方法的术语和

定义、缩略语、仪器设备及试剂、溶液配制、KASP引物信息、引物选择、操作程序、数据记录与统计、

结果应用等技术要求。

本文件适用于青稞品种及种质资源的鉴定。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB/T3543.2农作物种子检验规程扦样

GB/T3543.4农作物种子检验规程发芽试验

GB/T3543.5农作物种子检验规程真实性和品种纯度鉴定

GB4404.1粮食作物种子第1部分：禾谷类

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T19495.3转基因产品检测核酸提取纯化方法

GB/T30988多酚类植物基因组DNA提取纯化及测试方法

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

推荐引物

用本文件进行品种及种质资源鉴定时选用的一套SNP引物。

3.2

参照品种

具有所用SNP位点上不同等位变异的品种。

3.3

送检样品

送到种子检验机构检验的样品。

1

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3.4

试验样品

在实验室中从送检样品中分离出来的部分样品，供检验项目使用。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

DNA：脱氧核糖核酸（DeoxyriboNucleicAcid）

KASP：竞争性等位基因特异性PCR（KompetitiveAlleleSpecificPCR）

PCR：聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction）

SNP：单核苷酸多态性（SingleNucleotidePolymorphism）

5仪器设备及试剂

仪器设备及试剂见附录A，所用试剂均为分析纯。本文件所使用的超纯水应符合GB/T6682的要求。

6溶液配制

见附录B。

7KASP引物信息

分为Ⅰ、Ⅱ两组。见附录C

8KASP引物选择

首先选择附录C中Ⅰ组引物进行扩增。当样品间检测出的差异位点数小于2时，选用附录C中Ⅰ、Ⅱ

组所有引物进行扩增。

9操作程序

9.1样品准备

按照GB/T3543.5的规定，送检样品质量应符合GB4404.1粮食作物种子第1部分：禾谷类中对大

麦种子纯度的要求。试验样品的分样应符合GB/T3543.2的规定。按照GB/T3543.4的规定进行发芽，供

发芽的籽粒数须大于等于50粒。植株长至三叶一心时，按单株采取叶片进行样品制备。

9.2DNA样品制备

按照GB/T19495.3的方法或采用商用的植物基因组DNA提取试剂盒进行DNA的提取。每个送检品种制

备的DNA样品数量须大于等于50个单株；单提、单检。试验样品DNA纯度、浓度测试应符合GB/T30988

的规定。

9.3实时荧光定量PCR仪SNP分型

2

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SNP分型操作流程如下：

a)将2μLDNA样品编号后分别加到96孔PCR板上对应编号的反应孔中，每块PCR板均须加2

个阴性对照（即用2μL超纯水替代DNA样品，其余所加试剂完全一致）。每块PCR板只检测

一个送检品种。

b)依试验样品量，按照表1配制KASP基因分型混合液。配制前所有试剂均应涡旋振荡，补足损

失的体积。

表1KASP基因分型混合液

试剂体积（μL）

2×KASPMastermix5

Primer_Allele[FAM](10μmol/L)0.5

Primer_Allele[HEX](10μmol/L)0.5

Primer_Common(10μmol/L)1

超纯水1

总体积8

c)使用微量移液器将9.3SNP分型操作流程2）中的KASP基因分型混合液分别加入到9.3SNP

分型操作流程1）已加入DNA样品的PCR板上的反应孔中，每孔加8μL。

d)用荧光透视的膜将PCR板密封，然后转速3000rpm，离心时间30sec。

e)KASP反应在实时荧光定量PCR仪上进行，程序设置见表2。

表2实时荧光定量PCR反应程序

步骤说明温度时间循环数

1预变性94℃15min1

变性94℃20sec

210

复性/延伸61~55℃60sec（每循环降低0.6℃）

变性94℃20sec

326

复性/延伸55℃60sec

f)PCR反应结束后，在该仪器上进行荧光数据的读取，读取时程序设置为：温度30℃，时间60sec，

循环数1。

g)当数据对应的荧光信号较低，分群较散时，可以增加循环后进行荧光读取，同时保证阴性对照

没有被扩增。程序设置如下：94℃变性20sec，57℃复性/延伸60sec，此步骤进行3个循环。

再按照9.3SNP分型操作流程6）进行荧光数据的读取。

10数据记录与统计

样品每个SNP位点的等位变异采用荧光定量PCR仪检出的荧光信号表示。通过读取荧光信号确定试验

样品在该位点的等位变异并进行记录和统计。

11结果应用

当送检品种样品间差异位点数大于等于2，则判定为“不同品种”；当送检品种样品间差异位点数

等于1，判定为“近似品种”；当送检品种样品间差异位点数等于0，判定为“极近似品种或相同品种”。

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另外，可将试验结果直接与附录D参照品种SNP碱基类型进行比对，当与参照品种一致时，可以鉴定

为某一品种。

4

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AA

附录A

（规范性）

主要仪器设备及试剂

A.1主要仪器设备

实时荧光定量PCR仪、电子恒温不锈钢水浴锅、电子天平（精度0.01g、0.0001g各一台）、磁力

搅拌机、高速台式离心机、高通量组织研磨仪、微量分光光度计、高压灭菌锅、酸度计、微量移液器、

冰箱。

A.2主要试剂

乙二胺四乙酸二纳、三羟甲基氨基甲烷、盐酸、氢氧化钠、氯化钠、十六烷基三甲基溴化铵、β-

巯基乙醇、Tris-饱和酚、三氯甲烷、异丙醇、无水乙醇、2×KASPMastermix、KBDAssaymix、超纯水。

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BB

附录B

（规范性）

溶液配制

B.1DNA提取试剂

B.1.10.5mol/L乙二胺四乙酸二纳盐（EDTA）（pH8.0）溶液

称取9.305g的EDTA-Na2·2H2O，加40mL超纯水，充分溶解，用0.8g~1.1gNaOH固体调节pH至8.0，

定容至50ml。在103.4kPa（121℃）条件下灭菌20min，室温保存。

B.1.21mol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸（Tris-HCl）（pH8.0）溶液

称取6.06g的Tris，加40ml的超纯水，充分溶解。用1.8mL~2.2m